62ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 5. Genética Vegetal

EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS DE RAIZ DE FEIJÃO-CAUPI [Vigna unguiculata (L.) Walp] PARA ANÁLISE PROTEÒMICA

Renata Cruz de Castro 1 Nayara Patrícia Vieira de Lira 1 Maria Clara Pestana-Calsa 1 Mauro Guida dos Santos 2 Marciel Teixeira Oliveira 2 Tercilio Calsa Júnior 3

1. Depto. de Genética, Universidade Federal de Pernambuco - UFPE 2. Depto. de Botânica, Lab. de Fisiologia Vegetal - UFPE 3. Prof. Dr./ Orientador - Depto. de Genética - UFPE

INTRODUÇÃO:

O feijão-caupi é uma das leguminosas comestíveis mais adaptadas às condições brasileiras de clima e solo, muito cultivado no semi-árido nordestino, com elevado teor protéico e relevância como fonte nutritiva e na geração de empregos para esta região. As leguminosas, em geral, apresentam nódulos associados às raízes formados por bactérias do gênero Rhizobium que convertem o nitrogênio atmosférico diretamente em nitratos. Essa interação é benéfica à agricultura sustentável devido ao processo de Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN), mais importante em ambientes tropicais por compensar a baixa disponibilidade de nitrogênio no solo agravada pela lixiviação. Visando substituir adubos nitrogenados, a FBN tem sido alvo de estudos moleculares, como a análise proteômica via eletroforese bidimensional (2D-PAGE), técnica muito utilizada para identificação de proteínas. Os dados de proteoma complementam as informações genômicas e transcricionais. Este trabalho teve por objetivo extrair proteínas totais de raiz de feijão-caupi inoculada e não-inoculada com Rhizobium para posterior análise proteômica da interação feijão-caupi-rizóbio.

METODOLOGIA:

Foram utilizadas raízes de feijão-caupi da variedade BR-14 Mulato, cultivada em casa-de-vegetação, submetidas à inoculação ou não com rizóbio comercial BR3267 (semia6462, Instituto Agronômico de Pernambuco) e coletadas 35 dias após germinação. As proteínas foram extraídas por método fenólico, onde se adicionou tampão de extração e fenol, seguindo-se precipitação em acetato de amônia/metanol, lavagens em acetona e etanol e ressuspensão em uréia-tiuréia. A quantificação foi feita por espectrofotometria. A integridade das proteínas foi visualizada em gel de poliacrilamida 12%, e as mesmas foram fracionadas através de 2D-PAGE: na focalização isoelétrica foram aplicados 60µg em fitas IPG (pH 3-10, 11 cm, não-linear; GE Life Science). A segunda dimensão foi conduzida em géis gradiente 24cm precast (ExcelGel, GE Life Science), no sistema Multiphor II (GE Life Science) conforme protocolo recomendado pelo fabricante. Os géis foram corados com azul de Coomassie.

RESULTADOS:

Foram extraídos 1,68 mg/mL de proteínas para inoculado e 1,70mg/mL para não-inoculado, as quais foram submetidas a eletroforese em gel de poliacrilamida 12%, evidenciando proteínas com baixa degradação. A eficiência na extração protéica de raízes é de grande importância, pois a partir das análises das proteínas é possível investigar relações com funções biológicas. Este órgão apresenta menor teor de proteínas, além da necessidade de remover microorganismos e partículas de solo contaminantes e componentes fenólicos oxidantes. Foram obtidos extratos de proteínas em quantidade/qualidade suficiente para 2D-PAGE. Métodos que utilizam fenol são geralmente mais eficientes, pois remove componentes não protéicos que interferem na focalização isoelétrica, além da proteólise ser minimizada na presença deste componente. Nesta foi observada adequada resolução dos spots, os quais se encontram em sua maioria na faixa de pH 4-7, que é mais próximo ao pH fisiológico, e de peso molecular 14,4 a 97,0 kDa.

CONCLUSÃO:

O método fenólico apresentou alta eficiência para a extração protéica de raiz de feijão-caupi para análise proteômica via 2D-PAGE, dada a adequada resolução de peptídeos nos géis obtidos, sugerindo baixa degradação e menor presença de contaminantes e, portanto, corroborando dados disponíveis na literatura.

Instituição de Fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq; Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco - FACEPE

Palavras-chave: Método fenólico, Rhizobium, Vigna.