62ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 13. Parasitologia - 6. Parasitologia

OTIMIZACÃO DE UMA NESTED-PCR PARA DETECÇÃO DE DNA DE Leishmania (Viannia) braziliensis NO DIAGNÓSITICO DA LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA

Rafael Acioli Medeiros 1 Maria Almerice Lopes da Silva 1 Leandro Batista Wanderley 1 Otamires Silva 1 Zulma Medeiros 1 Fábio Lopes de Melo 1

1. Departamento de Parasitologia, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães

INTRODUÇÃO:

A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma doença infecciosa causada por protozoários do gênero Leishmania, no Brasil já foram identifcadas sete espécies. As três principais são: L. (V.) braziliensis, L.(V.) guyanensis e L.(L.) amazonensis e, mais recentemente, as espécies L. (V.) lainsoni, L. (V.) naif, L. (V.) lindenberg e L. (V.) shawi foram identificadas em estados das regiões Norte e Nordeste. É uma zoonose em franca expansão geográfica, sendo uma das infecções dermatológicas mais importantes, não só pela freqüência, mas principalmente pelas dificuldades terapêuticas, deformidades e seqüelas que pode acarretar. A LTA encontra-se, segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), entre as seis doenças infecto-parasitárias de maior importância. Na Região Nordeste, a Leishmania (Viannia) braziliensis é responsável pela maior quantidade de casos de LTA. Diante das dificuldades dos testes parasitológicos convencionais, ferramentas moleculares baseadas em PCR estão sendo desenvolvidas, destacando-se a Nested-PCR, que se realiza em duas etapas consecutivas (duas PCRs simples), o que aumenta a sensibilidade e especificidade do método. Logo, o presente estudo visa à otimização da proporção de primers internos e externos no desenvolvimento de sistemas baseados em Nested PCR para o diagnóstico da LTA.

METODOLOGIA:

O DNA genômico de L. (V.) braziliensis foi obtido com kits comerciais a partir de cultura, a partir do qual foram realizadas diluições na escala de 1 ng a 0.01 fg. Foram realizados experimentos com proporções dos primers externos R221 e R332 (1, 2, 3, 5 e 10 pmol) e os primers internos LITSR e L5.8S (25 e 50 pmol) para otimização das duas PCRs simples e da Nested. Os resultados foram analisados em um gel de agarose a 2% com amostras coradas por blue green e posteriormente visualizados em UV. Os experimentos foram realizados no Laboratório de Doenças Transmissíveis do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/FIOCRUZ.

RESULTADOS:

As maiores sensibilidades para as PCRs simples foram obtidas com os sistemas que utilizaram 5 pmol dos primers externos (com 10 pmol obteve-se o mesmo resultado), amplificando até 1 pg de DNA genômico, e 50 pmol de primers internos, amplificando até 100fg. Para o sistema de Nested-PCR, aplicou-se as concentrações supracitadas, alcançando uma sensibilidade de 10 fg, correspondendo a menos de um parasito.

CONCLUSÃO:

Muitos estudos apontam a dificuldade de diagnósitco da LTA pelas técnicas usuais (parasitológica e sorológicas), e ressaltam a pesquisa de ferramentas moleculares. Estas são mais sensíveis, permitindo um diagnóstico precoce. Nosso sistema apresentou bons resultados preliminares e, em uma próxima etapa, será validado com amostras biológicas.

Palavras-chave: Nested-PCR, Leishmaniose tegumentar Americana, Leishmania (Viannia) braziliensis.