62ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 6. Bioquímica

EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DE PROTEASES DO LÁTEX DE Brosimum parinarioides Ducke UTILIZANDO O SISTEMA DE DUAS FASES AQUOSAS (PEG-FOSFATO)

Rosana Antunes Palheta 1 Tatiana Porto 2 Milena Silva Fernandes 2 Ana Lucia de Figueiredo Porto 2 Maria Francisca Simas Teixeira 1, 3

1. Prog de Pós Grad em Diversidade Biológica, Universidade Federal do Amazonas/UFAM 2. Dep de Morfologia e Fisiologia Animal, Univ. Federal Rural de Pernambuco/UFRPE 3. Doutora/Orientadora

INTRODUÇÃO:

Brosimum parinarioides conhecido popularmente como amapazeiro é uma espécie arbórea com 35 a 40 metros de altura, encontrada em áreas de floresta de terra firme e várzea na Amazônia. Seu caule possui canais laticíferos que produzem o látex, uma complexa mistura de moléculas composta de cálcio, ferro, magnésio, alcalóides, antraquinonas, derivados de cumarina, purinas, esteróides e triterpenóides e enzimas proteolíticas, todos associados a diferentes tipos de aplicações farmacológicas. Na Amazônia, o látex de amapazeiro tem aplicação no tratamento de inflamação, diarréia, hemorróidas, desnutrição, problemas pulmonares, gastrite e cicatrização de ferimentos, no entanto possui propriedades químicas ainda desconhecidas, apesar dessas características benéficas. Assim, o objetivo deste trabalho foi estudar a partição das proteases do látex de B. parinarioides utilizando-se os sistemas de duas fases aquosas (SDFA).

METODOLOGIA:

As amostras de látex de B. parinarioides foram extraídas de árvores selecionadas na floresta do Campus da UFAM em Manaus-AM e em seguida enviadas sob refrigeração ao laboratório para posterior beneficiamento e clareamento, obtendo-se o extrato enzimático. Um planejamento fatorial 24 foi elaborado para o preparo dos SDFA. Estes, com massa total de 6g, foram compostos de soluções estoque de sais de fosfato 40% (m/m), obedecendo a relação entre fosfato monobásico e bibásico com diferentes valores de pH (6,0; 7,0 e 8,0) à 25 oC. Em tubos cônicos graduados (15 mL), as quantidades necessárias (CFOSF=15%, 20% e 25%) de cada uma dessas soluções foram misturadas a solução de polímero 50% (m/m) com massa molar (MMPEG) de 400, 4000 e 8000, nas concentrações (CPEG=12,5%, 15%,17,5%). O conteúdo destes tubos foi agitado em vórtex, adicionando-se em seguida 20% do extrato enzimático. Após agitação em vórtex, os SDFA permaneceram em repouso até separação das fases, o volume das fases foi medido, e as fases foram coletadas separadamente e analisadas quanto a concentração de proteínas totais (Bradford, 1976) e atividade de protease (Leighton, 1973). Para avaliação da purificação pelo SDFA foram analisadas as respostas coeficiente de partição (k), fator de purificação (PF) e rendimento (Y).

RESULTADOS:

Os experimentos (n=20) realizados por SDFA mostraram que as proteases extraídas de B. parinarioides particionaram preferencialmente para a fase superior do sistema (fase rica em PEG) (K > 1). Isto pôde ser evidenciado pelo aumento da concentração de sais de fosfato, pois quanto maior a concentração destes sais nos sistemas maior foi o valor do coeficiente de partição (K). Em relação ao fator de purificação (PF) os valores variaram de 0,31 a 1,59. Essa variável resposta sofreu influência significativa das variáveis MMPEG, CFOSF e pH, apresentando o maior valor nos níveis mais altos dessas variáveis. Quanto ao rendimento da proteína (Y), alguns valores foram superiores a 100%, demonstrando que provavelmente a enzima teve seu sítio ativo alterado pela presença do PEG no sistema ou a eliminação de inibidores no SDFA causou este aumento, observou-se significância das variáveis respostas do planejamento assim como as interações entre elas. O melhor sistema considerando-se as três variáveis respostas foi MMPEG (m/m) 8000, CPEG 12,5%, pH 8 e CFOSF 25% com valores de k = 32,73, PF= 1,59 Y = 222,22.

CONCLUSÃO:

Os experimentos utilizados neste trabalho mostraram, pelo resultado das variáveis: coeficiente de partição, rendimento e fator de purificação, que os SDFA são importante ferramenta para otimização de processos de purificação de baixo custo para enzimas.

Instituição de Fomento: FAPEAM, CAPES e CNPq

Palavras-chave: Partição, Enzimas, Látex.