62ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 5. Genética Vegetal

TRANSCRIPTOMA DE SEQUÊNCIAS EXPRESSAS SUPERSAGE EM FOLHAS DE FEIJÃO CAUPI [Vigna unguiculata (L.) Walp] COM DANO MECÂNICO

Igor Cavalcanti de Oliveira 1 Ricardo Luiz Alves dos Santos 1 Manassés Daniel da Silva 1 Carolina Neves Correia 1 Ana Maria Benko-Iseppon 1 Éderson Akio Kido 1

1. Depto. de Genética, Universidade Federal de Pernambuco - UFPE

INTRODUÇÃO:

O feijão-caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp] é um dos principais componentes da dieta alimentar nas regiões Nordeste e Norte do Brasil, em especial na área rural, constituindo uma excelente fonte de proteínas, aminoácidos essenciais, carboidratos, vitaminas e minerais. Apesar de grande potencial sócio-econômico, inclusive para exportação, é uma espécie pouco estudada. Estudos de genômica funcional são importantes pelo conhecimento de como os organismos e as vias metabólicas se expressam sob determinadas situações, como seca, doenças e outros estresses. A técnica SuperSAGE tem sido utilizada em transcriptômica, apresentando vantagens em relação a outros métodos, tais como a possibilidade tanto de análise qualitativa e quantitativa de milhões de transcritos, sendo de arquitetura aberta e não necessitando de conhecimento prévio das sequências. Com o intuito, de conhecer a resposta do feijão-caupi ao dano mecânico acarretado em folhas, a técnica foi aplicada visando identificar transcritos diferencialmente expressos na condição de estresse, em relação ao controle, para posterior identificação de alvos moleculares que possam ser úteis no melhoramento vegetal. Esse tipo de dano simularia a ação de herbivoria, sendo também porta de entrada para patógenos.

METODOLOGIA:

Plântulas de feijão-caupi (BR14-Mulato) foram cultivadas em casa de vegetação (Departamento de Genética, UFPE). Quatros semanas após germinação, 20 plântulas sofreram dano com material abrasivo, enquanto o mesmo número não sofreu dano algum. Folhas foram amostradas em tempos pré-determinados após o estresse (30, 60 e 90 min e 16 h). Essas foram imediatamente congeladas até extração de RNA total, seguido de purificação de poliA-RNA e geração de bibliotecas SuperSAGE [controle (sem dano mecânico; C) e injuriada (amostra conjunta dos diferentes tempos; E)], conforme Matsumura et al. (2003), com modificações. Bibliotecas foram seqüenciadas (pirossequenciamento) na empresa GenXPro (Alemanha). Tags de 26 pb foram extraídas e analisadas (software DiscoverySpace 4.0) para identificação das mais diferentemente expressas (p < 0,05). Bibliotecas foram normalizadas para 100.000 tags. Modulação da expressão de uma tag (FC) foi feita considerando a relação das freqüências dessa tag nas bibliotecas injuriada em relação ao controle. Tags foram anotadas via BLASTn contra bancos de dados públicos (NCBI, Gene Index e TIGR), considerando-se o melhor escore (máximo de 52).

RESULTADOS:

As bibliotecas SuperSAGE permitiram seqüenciar 269.611 tags, das quais 137.552 da biblioteca C e 132.059 da biblioteca E, sendo 10.854 tags consideradas únicas. Destas, 1.867 foram exclusivas da biblioteca C e 1.998 da biblioteca E. Após análise estatística, 1.398 tags foram consideradas superexpressas (p < 0,05), cujos FCs variaram de 1,2 a 98,4, enquanto que 996 tags tiveram a expressão reprimida após a aplicação do estresse (FC de -1,2 até -142,8), e 8.460 não variaram significativamente. Dentre as superexpressas, 938 tags alinharam com sequências expressas de diferentes bases de dados (banco local de feijão-caupi e outras leguminosas como feijão-comum e soja), com escore máximo (52) ou apenas uma diferença nas bases alinhadas (escore 50). Dessas, 677 puderam ser anotadas com base na descrição da sequência similar, das quais várias relacionadas com diversos estresses. Outras 261 tags apesar de apresentarem sequências similares, não continham nenhuma descrição de gene/função, ao passo que 362 tags não apresentaram sequências similares nos bancos pesquisados. Essas últimas podem ser potenciais alvos. Já entre os reprimidos, 656 tiveram alinhamentos com escores 50 ou 52 (507 com descrição de gene/função); 68 com escores de 48 - 42 e 272 tags não apresentaram sequências similares.

CONCLUSÃO:

A análise das bibliotecas SuperSAGE permitiu identificar tags diferencialmente expressas, muitas das quais sem sequências similares depositadas em bancos de dados públicos, evidenciando possíveis novos genes. A validação de alvos diferentemente expressos via RTqPCR poderá confirmar a importância dos mesmos na compreensão da resposta ao estresse estudado, bem como no uso potencial e futuro no melhoramento dessa espécie.

Instituição de Fomento: FINEP

Palavras-chave: SuperSAGE, Expressão Diferencial, Estresse Mecânico.