62ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 1. Biofísica - 3. Biofísica Molecular

implementação de métodos avançados de RMN para estudo de proteínas de tamanhos pequeno a grande.

Jorge Neves 1 Mauricio Sforca 1 Ana Zeri 1

1. Laboratorio Nacional de Biosciencias - CNPEM (Campinas-SP)

INTRODUÇÃO:

Avanços tecnológicos na área de Ressonância Magnética Nuclear têm permitido que esta técnica seja aplicada não somente na determinação de estruturas tridimensionais de proteínas pequenas e médias (10 - 20 kDa), mas também para estudar a dinâmica de interação destas com outras macromoléculas. Entretanto, fatores como longos tempos de medidas e o grande número de sinais sobrepostos, aliados à perda da sensitividade da técnica, à medida que o peso molecular aumenta, ocultam o potencial da técnica para estudar proteínas maiores que 20 kDa. Motivados pela grande importância da RMN para tais estudos, mostraremos neste trabalho, a implementação de avançadas metodologias de RMN, capazes de acelerar a coleta dos experimentos e ampliar a gama de aplicações das instalações de RMN do LNBio para ácidos nucléicos e proteínas grandes.

METODOLOGIA:

Será mostrado neste trabalho, a implementação do método da Reconstrução da Projeção (PR-NMR para acelerar a coleta de dados experimentais), experimentos de correlação bidimensionais 1H-31P (para o estudo de interação ácidos nucléicos - proteínas) e experimentos CRIPT, TROPIC e CRINEPT (para estudar proteínas grandes). Além disso, desenvolvemos um sistema Linux virtualizado, executado como máquina convidada em diversos sistemas hospedeiros (Windows, Linux, Macintosh) e que inclui um conjunto de softwares livres pré-instalados, necessários para o processamento de dados de RMN e cálculo de estrutura. É apenas necessário que os usuários cadastrem-se por e-mail junto aos desenvolvedores dos softwares.

RESULTADOS:

O tempo experimental requerido para coleta de um espectro HNCO, reduz-se de 24 h (convencional) para 2 h (reconstruído). Um número maior de projeções espectrais pode ser usado, o que possibilita um melhoramento na qualidade dos espectros, à custa do aumento no tempo de coleta. Testes experimentais das seqüências 1H-31P HSQC mostraram-se satisfatórios e um espectro foi coletado para o DNA (5'TAATACGACTCACTATAGGG'3). Este teste sinal permite que estas seqüências sejam úteis para estudos de interação DNA - proteína. As seqüências CRIPT, TROPIC e CRINEPT foram implementadas com sucesso para sistemas modelos. Características de cada experimento foram investigadas usando o método teórico de produto de operadores. Em relação ao sistema Linux virtualizado, todas as etapas de instalação e testes foram concluídas. Estamos distribuindo o disco virtual e o virtualizador, para que usuários externos do laboratório de RMN do LNBio, para que os mesmos possam processar e tratar os dados de RMN estrutural de moléculas biológicas.

CONCLUSÃO:

Esperamos que todas as metodologias implementadas neste trabalho, possam ser estendida para outros laboratórios brasileiros de RMN de biologia estrutural. A redução no tempo experimental possibilita que proteínas consideradas instáveis, possam ser estudadas. Do ponto de vista de interação DNA - proteína, espectros de HSQC de 31P possibilita que estes estudos para alguns casos possam ser conduzidos sem a necessidade de marcação isotópica da proteína. Por outro lado, a implementação de métodos avançados de RMN para moléculas biológicas acima de 30 kDa, amplia o conjunto de moléculas passiveis de serem estudadas em nosso laboratório, sem a necessidade de mudança no equipamento de RMN.

Instituição de Fomento: FAPESP

Palavras-chave: RMN, Sequencia de Pulsos, Proteinas.