62ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 9. Imunologia - 2. Imunologia Celular

Avaliação da resposta imune celular através da produção de óxido nítrico de bovinos naturalmente infectados por tuberculose (Mycobacterium bovis).

Hidelbrando Ricardo Domeneguete Amaral 1 Ediane Batista da Silva 2 Ana Paula Junqueira Kipnis 3

1. Depto. de Imunologia, IPTSP - UFG 2. Depto. de Imunologia, IPTSP - UFG 3. Profa. Dra./ Orientadora, Depto. de Imunologia, IPTSP - UFG

INTRODUÇÃO:

A tuberculose bovina (Tb bovina) é uma zoonose de distribuição mundial e sua prevalência é maior nos paises em desenvolvimento. De acordo com a OMS 30 milhões de pessoas morreram de Tb da década de 90. Na China 5~10% das pessoas infectadas por Tb são devido ao Mycobacterium bovis (M.bovis). A Tb bovina é uma doença crônica granulomatosa que envolve pulmões e linfonodos. A resposta imunológica predominante é realizada por linfócitos T e macrófagos. O macrófago é a célula primordial na imunidade contra o M. bovis. Quando estimulado por IFN- g e TNF-α é capaz de produzir uma potente molécula micobactericida, o óxido nítrico (NO). A determinação das concentrações de NO em animais naturalmente infectados por M. bovis pode colaborar para o entendimento da resposta imune inata e específica a este patógeno. A estimulação in vitro de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) com antígenos específicos de M. bovis pode estimular linfócitos efetores a produzirem INF-g levando os macrófagos contidos no PBMC a produzirem NO. O presente trabalho propõe estudar a resposta imune celular de bovinos naturalmente infectados com M. bovis. Para isto quantificamos a produção de NO produzido pelo PBMC de bovinos quando estimulados com Ag85, M. bovis BCG e M. bovis isolado no estado de Goiás.

METODOLOGIA:

Utilizou-se 13 fêmeas bovinas (29 a 84 meses de idade) da raça Holandesa, reagentes ao teste de tuberculina intradérmico comparativo (TTI) e 6 animais negativas para o mesmo teste. Após o diagnóstico os animais foram submetidos ao abate sanitário (dos bovinos positivos, 35% apresentavam lesões visíveis, nenhum apresentava sinais e sintomas de Tb). Para avaliação do NO coletou-se 20mL de sangue da jugular em tubo heparinizado de cada animal de forma asséptica. O isolamento de PBMC foi processado segundo VESOSKY et al. (2004). A concentração celular foi ajustada em 107 células/mL. Utilizaram-se 2μg/mL do Ag85,e 10 μg/mL de BCG M. bovis. As células isoladas foram incubadas em meio cRPMI em estufa de CO2 a 5% a 37°C, por 72 horas. Para verificar se animais saudáveis respondiam a infecção, fez-se uma cultura apenas de macrófagos e estes foram estimulados com BCG M. bovis e M. bovis isolado de um dos animais infectados ajustados a uma OD de 0,2. Nos tempos de 24h, 48h e 72 h, 50μl do sobrenadante da cultura de células foram removidos e colocados em quadruplicata, para quantificação do produto de oxidação estável do óxido nítrico, o nitrito (NO2-). A concentração de NO2- foi mensurada pelo método colorimétrico de Griess, com leitura em leitor ELISA  automático a 595 nm.

RESULTADOS:

Quando o PBMC das reagentes ao TTI foram estimulados pelo Ag85, valores médios encontrados foram de 6,21±3,64 para os animais infectados e de 6,28 ± 3,03 para o grupo controle, não se observando diferença significativa entre os dois grupos (p>0,05). A avaliação da produção de NO na presença do Ag85 foi de caráter inovador, não tendo sido encontrado relatos na literatura consultada. Também não houve diferença significativa quando o PBMC foi estimulado com M. bovis-BCG [positivos (7,53 ± 4,32) e grupo controle (8,43 ± 7,12)]. Isto se deve provavelmente ao fato de utilizarmos extrato protéico total que contêm diversas moléculas que são capazes de induzir a ativação de macrófagos via Receptores Tipo Toll gerando NO independente da origem destas células, se de animais positivos ou negativos. Devido à ausência de resposta diferencial satisfatória, macrófagos de animais saudáveis foram desafiados com M. bovis-BCG e com M. bovis isolado de um dos animais infectados. Com 72h de cultura houve uma produção de 24,14 ± 5,37 de NO pelos macrófagos estimulados com M. bovis isolado, e 18,74 ± 6,32 quando infectado com M.bovis-BCG. Esses resultados podem inferir numa possível maior virulência do M. bovis recém isolado quando comparado com o M. bovis-BCG (cepa de baixíssima virulência).

CONCLUSÃO:

A produção de NO em bovinos naturalmente infectados por tuberculose apresenta-se elevada na presença Ag85, e BCG, no entanto, não há discriminação entre estes e o grupo controle. O fato de o grupo controle possuir uma média mais elevada de produção de NO em relação ao grupo infectado, mesmo que estatisticamente insignificante, pode indicar que os macrófagos dos animais infectados encontram-se debilitados pela infecção, não respondendo bem ao desafio. Em bovinos o Ag85 tem sido estudado com o propósito de aplicação no diagnóstico da Tb bovina. A infecção dos macrófagos de animais saudáveis mostrou que estes respondem com maior produção de NO ao estímulo do M. bovis isolado (bacilos vivos) do que os desafiados com M.bovis-BCG. O efeito do NO poderia ser utilizado em tratamento de pacientes multi-droga resistente assim como método auxiliar no diagnóstico da tuberculose bovina, já que no campo da medicina veterinária, encontram-se dificuldades em detectar a enfermidade.

Instituição de Fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq

Palavras-chave: Tuberculose bovina, Macrófago, Óxido Nítrico.