62ª Reunião Anual da SBPC

D. Ciências da Saúde - 5. Farmácia - 6. Farmácia

ANÁLISE COMPARATIVA ENTRE A EFICIÊNCIA DE DETECÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO TUMORAIS POR MORFOLOGIA E POR CITOMETRIA DE FLUXO

Andrea Barretto Motoyama 1 Victor Henrique F. de Mendonça Santiago de Paula 1 Sílvia Taveira Elias 1 Eliete Neves da Silva Guerra 2

1. Laboratório de Farmacologia Molecular, Faculdade de Ciências da Saúde / FS-UnB 2. Departamento de Odontologia, Faculdade de Ciências da Saúde / ODT-FS-UnB

INTRODUÇÃO:

O câncer oral, ou carcinoma do tecido escamoso da mucosa oral (OSCC), é o oitavo tipo mais comum de câncer, sendo responsável por cerca de 300.000 mortes por ano em todo o mundo. Hábitos como o alcoolismo e o tabagismo, cada vez mais comuns e emergentes no contexto atual, justificam em parte a crescente prevalência deste carcinoma, já que sabe-se que estes fatores, isolados ou combinados, contribuem significativamente para um maior risco de câncer oral e também para um pior prognóstico dos pacientes acometidos. O tratamento do câncer oral geralmente envolve a cirurgia combinada com radio e quimioterapia; tendendo a ser bastante invasivo e impactante para a vida social do paciente, inclusive porque quando este não ocorre de maneira completamente eficiente as recidivas são comuns. A utilização de drogas convencionais isoladamente não é eficaz pelo bloqueio promovido por possíveis mecanismos intracelulares. Recentemente surgiu um novo conceito na biologia do câncer que defende a existência de um grupo restrito de células que apresenta características comuns as de células tronco, como a pluripotencialidade (capacidade de diferenciação em outros tipos celulares) e capacidade de divisão assimétrica, além da capacidade de exclusão de corantes. A existência dessas subpopulações celulares, geralmente em número restrito, ajuda a explicar a dificuldade de tratamento do carcinoma oral com a terapia convencional, já que células tronco em geral costumam excluir compostos químicos estranhos de seu interior (o que poderia acontecer com os quimioterápicos). Essas células multipotenciais presentes nos tumores, denominadas células tronco tumorais (ou cancerígenas), seriam responsáveis pela proliferação persistente do tumor, e até mesmo pelo seu restabelecimento, após a remissão, justificando as altas taxas de reincidência após a remoção cirúrgica da área comprometida. Essa teoria é reforçada por estudos em modelos animais xenográficos que constataram o surgimento de tumores após injeção de pequenas quantidades de células tumorais previamente selecionadas como células tronco por meio do uso de marcadores de superfície específicos, enquanto que foi necessário injetar um número de células não previamente selecionadas cerca de dez vezes maior para se alcançar a formação do tumor. Além disso, foi observado que o novo tumor formado por células selecionadas era tão heterogêneo quanto o tumor do qual as células foram originalmente isoladas. Embora a maioria das células-tronco tumorais tenha sido descrita e/ou isolada a partir de seus marcadores de superfície, há na literatura relatos de isolamento a partir da morfologia de colônias, quando essas células são cultivadas in vitro. Tais células foram classificadas em holoclones (colônias mais agrupadas e com maior potencial replicativo) e paraclones (colônias mais dispersas com potencial replicativo limitado). A caracterização a nível molecular desses clones poderia fornecer as bases para um diagnóstico mais preciso e precoce, com a utilização de diminuta quantidade de material, bem como o entendimento das bases biológicas da doença, facilitando seu prognóstico. Ainda, isolamento e caracterização das células tronco tumorais são passos importantes para possíveis formulações de novas estratégias terapêuticas que atinjam tais células e assim evitem o surgimento de novos tumores a partir de células tronco tumorais do tumor inicial. Assim, o presente projeto teve como objetivo analisar a expressão diferencial de genes relacionados à pluripotencialidade em paraclones e holoclones isolados a partir de linhagens celulares e de biópsias de pacientes atendidos no Hospital Universitário de Brasília.

METODOLOGIA:

1- Cultivo das biópsias recolhidas: As biópsias recolhidas no Centro de Câncer Bucal do HUB foram mantidas em solução salina estéril sob refrigeração até o cultivo. Este incluiu a lavagem da biópsia com soro fisiológico e subseqüentes digestão com tripsina e centrifugação. Após esse processo inicial a biópsia foi triturada e mantida em meio FAD completo, sendo este trocado a cada 1-2 dias, dependendo do crescimento do material e consumo dos nutrientes disponíveis. O crescimento das biópsias cultivadas foi constantemente monitorado. 2- Isolamento de colônias de paraclones e holoclones: Diante do não-estabelecimento adequado do protocolo de cultivo das biópsias, células OSCC-3 foram cultivadas em meio DMEM e em baixas densidades para posterior isolamento. As culturas obtidas foram observadas em microscópio ótico e a localização de cada tipo de colônia foi marcada na placa. As colônias marcadas eram isoladas pela fixação de anéis de clonagem de poliestireno esterilizados contendo vaselina em sua base. A matriz extracelular das células isoladas era digerida com tripsina e esta inativada com DMEM. A solução de células obtida foi transferida para uma placa de 96 poços e o crescimento das colônias isoladas foi monitorado, incluindo troca do meio de cultivo quando necessária. 3- PCR para amplificação de genes marcadores de células-tronco: As culturas de células OSCC-3 anteriormente citadas sofreram extração do RNA total para posterior utilização na síntese de cDNA mediada por transcriptase reversa. Esse DNA foi submetido a reação em cadeia da polimerase (PCR) com a utilização de primers para os genes GAPDH e NOTCH-3. O primeiro foi utilizado como controle por ser constitutivamente expresso em todos os tipos de células, enquanto os demais foram utilizados por serem marcadores já conhecidos de células tronco. O amplificado obtido foi submetido a eletroforese em géis de agarose 1,5 e 2% para observação dos resultados obtidos.

RESULTADOS:

Os experimentos propostos foram prejudicados pela falta do recolhimento de um número maior de biópsias e pela dificuldade de cultivá-las, já que das sete biópsias recebidas, apenas duas iniciaram crescimento em cultivo e após algum tempo sofreram contaminação. Desta forma, não foi possível iniciar as análises propostas com as biópsias recolhidas. Por esse motivo, iniciou-se o cultivo de células OSCC-3 e o isolamento de holoclones e paraclones a partir destas de acordo com os métodos descritos, mesmo que os resultados obtidos não tenham a mesma relevância do que os obtidos com biópsias. A obtenção de culturas contendo exclusivamente um tipo de clone foi bastante satisfatória, dando origem a estoques que foram criopreservados a -80º para uso em experimentos posteriores. A análise da expressão gênica por PCR do material genético extraído das culturas de OSCC-3 não evidenciou a amplificação de NOTCH-3 na cultura estudada. Além disso, o protocolo de cultivo das biópsias está sendo aprimorado para que os experimentos inicialmente propostos possam ser realizados e os experimentos já realizados complementados e/ou validados em culturas primárias.

CONCLUSÃO:

As dificuldades encontradas no cultivo de biópsias e na obtenção de culturas celulares primárias sugeriu a utilização de uma linhagem in vitro já estabelecida, mesmo que características fenotípicas e de expressão gênica se percam neste tipo de linhagem. Tais dificuldades acabaram por tornar o tempo destinado a esse estudo insuficiente para caracterizar o perfil de expressão gênica diferencial entre holoclones e paraclones, além da caracterização dos mesmos pela citometria de fluxo. Entretanto, os experimentos realizados foram capazes de estabelecer um protocolo bastante satisfatório de isolamento de holoclones e paraclones a partir de culturas de células OSCC-3. Além disso, as PCRs mostraram que em tais células não há a expressão do gene NOTCH-3, geralmente presente em células tronco. Tal evidência sugere que não há a expressão deste gene em células OSCC-3 ou que esta se perdeu durante o estabelecimento da linhagem. A realização de PCRs para outros genes possibilitará conhecer melhor o perfil de expressão gênico destas células e por consequência as possíveis diferenças entre holoclones e paraclones. Adicionalmente, o aprimoramento do protocolo de cultivo de biópsias e isolamento de clones a partir destas possibilitará a validação dos experimentos já realizados e a realização de outros ainda propostos. O estudo em questão possibilitou o estabelecimento de um protocolo satisfatório para o isolamento de clones a partir de linhagens celulares e iniciou a análise do perfil de expressão gênica de células OSCC-3, sendo assim um importante passo para que os objetivos iniciais do mesmo sejam totalmente alcançados e para que estudos mais aprofundados possam ser iniciados. A futura caracterização de tais tipos clonais possibilitará a formulação de novas estratégias terapêuticas que tornem o tratamento do carcinoma oral menos invasivo e mais eficaz, possibilitando maior conforto e dignidade aos pacientes acometidos.

Instituição de Fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq

Palavras-chave: células tronco tumorais, terapia celular, OSCC.