| C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 3. Enzimologia |
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| CARACTERIZAÇÃO DE UMA EXO-QUITINASE PARCIALMENTE PURIFICADA EXTRAÍDA DO CEFALOTÓRAX DO CAMARÃO MARINHO Litopenaeus schmitti |
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Roberta Luciana do Nascimento Godone 1
Themis Taynah da Silva Santana 1
Luiz Roberto Diz de Abreu 1
Luciana Duarte Martins da Matta 1
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1. Departamento de Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte/UFRN
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| INTRODUÇÃO: |
| Quitinases são glicosilhidrolases que estão envolvidas na degradação da quitina, um polímero linear no qual a unidade repetitiva é o dissacarídeo formado por N-acetil-D-glucosamina unidas por ligação glicosídica do tipo b- 1,4. A quitina, um dos polímeros naturais mais abundantes, é encontrada nas cutículas de insetos, na casca de crustáceos, e nas paredes celulares de muitos fungos. As quitinases estão presentes em uma ampla gama de organismos, incluindo os que não contêm quitina, tais como bactérias, vírus, plantas e animais, e desempenham importantes papeis fisiológicos e ecológicos. A quitina é hidrolisada por um sistema quitinolítico classificado como: Endo-quitinases, Exo-quitinases e b-N-acetilglucosaminidase. A identificação e purificação dessas enzimas se prestam à necessidade de caracterizar quimicamente estes compostos originados de diferentes fontes, que apresentam funções diversas ou ainda, produzir oligossacarídeos modificados quimicamente com a intenção de estudar as interações de determinadas regiões destas moléculas com proteínas específicas, como também as funções farmacológicas dos oligossacarídeos formados. Este trabalho objetiva identificar e purificar uma β-N-acetilglucosaminidase extraída do cefalotórax do camarão marinho Litopenaeus schimitti. |
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| METODOLOGIA: |
| O cefalotórax dos camarões foram removidas e homogeneizados em tampão acetato de sódio 0,1 M pH 5,0. Em seguida, centrifugados e os extratos brutos utilizados para posterior fracionamento com sulfato de amônio em três etapas. A fração F-III do cefalotórax do camarão foi submetida à Cromatografia de troca iônica DEAE-Biogel onde a enzima foi eluída com tampão fosfato de sódio acrescido de NaCl na concentração de 0,2 M, em seguida estas frações foram reunidas e submetidas a uma Cromatografia de exclusão molecular Superose-12 sob sistema FPLC AKTA Purifier. Todas as etapas foram realizadas a 4ºC. O perfil de eluição protéica foi determinado por absorção a 280 nm. As atividades enzimáticas foram determinadas utilizando-se como substrato o PNF-N-acetil-b-D-Glucosaminídeo durante 30 min a 37ºC (para o extrato bruto, F-I, F-II e F-III) e 3 horas a 37ºC (para as frações eluídas das cromatografias). O p-nitrofenol liberado foi lido a 405 nm em espectrofotômetro. As frações provenientes do Extrato Bruto, F-III, 0,2 M de NaCl da DEAE-Biogel e as eluídas da Superose-12 foram submetidas a SDS-PAGE a fim de se obter o grau de purificação e o peso molecular da enzima. Foram observados influência da temperatura e estabilidade térmica da enzima, influência do pH, e determinação do (Km). |
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| RESULTADOS: |
| Os resultados iniciais mostraram que, de todas as atividades encontradas, a β-N-acetilglucosaminidase foi a que mais se sobressaiu em todas as frações testadas. A fração F-III, por apresentar maior precipitação da enzima de interesse, foi submetida a uma cromatografia de troca iônica DEAE-Biogel. A enzima foi eluída no pico protéico a 0,2 Molar de NaCl. Após a obtenção da β-N-acetilglucosaminidase na cromatografia de troca iônica foi realizado um novo passo cromatográfico a fim de obter ainda mais pura a enzima. As frações eluídas a 0,2 M de NaCl desta coluna foram reunidas e aplicadas numa gel filtração no sistema FPLC, onde se pode observar que, a β-N-acetilglucosaminidase foi eluída em um pico único. Este resultado foi confirmado quando aplicou-se alíquotas destas frações em SDS-PAGE. Neste foi observado a presença de duas bandas protéicas. Após serem comparados os pesos moleculares aos obtidos através da exclusão molecular pode-se chegar a conclusão que a enzima apresenta uma única banda de 36 kDa. Na determinação dos parâmetros cinéticos ideais para a catálise do substrato pela β-N-acetilglucosaminidase, encontrou-se atividade ótima em pH variando de 5,0 a 6,0, temperatura ótima a 55°C e ótima estabilidade térmica. A enzima apresentou Km aparente de 0,51 mM. |
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| CONCLUSÃO: |
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Neste trabalho pode-se observar que a fração F-III (50-80%) do cefalotórax do camarão apresentou maior atividade da enzima β-N-acetilglucosaminidase classificada como uma exo-quitinase. Na cromatografia de Troca Iônica DEAE-Biogel, a enzima β-N-acetilglucosaminidase apresentou maior atividade quando eluída nas frações correspondentes aos picos 0,2 M de NaCl e na cromatografia de Gel Filtração a enzima β-N-acetilglucosaminidase foi eluída em um pico único demonstrando boa purificação da enzima, resultado este confirmado após a realização da SDS-PAGE onde se verificou a presença de apenas duas bandas protéicas. A temperatura ótima para a catálise do substrato sintético pela β-N-acetilglucosaminidase é de 55°C, com elevada estabilidade térmica. A enzima ainda apresentou atividade ótima atuando em uma faixa de pH entre 5,0 e 6,0 e o Km foi de 0,51 mM, indicando que a enzima possui alta afinidade pelo substrato. | |
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| Instituição de Fomento: CNPq, UFRN e FAPERN |
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| Palavras-chave: Quitinases, Purificação, Litopenaeus schmitti. |