62ª Reunião Anual da SBPC

A. Ciências Exatas e da Terra - 4. Química - 8. Química

RESPOSTA DA REGULAÇÃO CARBONO - NITROGÊNIO NA PRODUÇÃO BIOTECNOLÓGICA DE MICROMOLÉCULA COM ATIVIDADE BIOLÓGICA

Nelson Rosa Ferreira 1 Maria Inês de Moura Sarquis 2 Alberdan Silva Santos 3

1. Pós-graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos; Universidade Federal do Pará 2. Laboratório de Coleção de Cultura de Fungos, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz-RJ 3. Laboratório de Investigação Sistemática em Biotecnologia e Química Fina, UFPa

INTRODUÇÃO:

A produção de substâncias químicas por processo biotecnológico pode ser realizada por transformações enzimáticas ou por microorganismos íntegros. Baseado na hipótese de que os microorganismos podem ser manipulados adequadamente de modo a realizarem conversões de substratos naturais em substâncias de interesse, têm-se utilizado fungos filamentosos como agente de biotransformação, os quais apresentam potencial de produzir metabólitos secundários e excretá-los para o meio, com maior facilidade do que as bactérias ou leveduras. Neste contexto Aspergillus flavus (IOC 3974) foi utilizado na produção do metabólito secundário, denominado 5-hidroxi-2-hidroximetil-γ-pirona (HGP), que pertence ao grupo das γ-pironas. Este metabólito e seus derivados apresentam aplicações já conhecidas em diversos segmentos, tais como: inibidor da tirosinase e polifenoloxidase, agente quelante de metais de transição e substância radioprotetora . O HGP foi divulgado pela primeira vez em 1907 por Saito durante seus estudos da fermentação de arroz com Aspergillus oryzae. Desde então, vários trabalhos foram realizados para a descoberta de novos microrganismos e de substratos que possam ser utilizados na produção desta substância. Neste estudo foi utilizada a sacarose comercial como substrato para obtenção do metabólito de interesse. Este substrato possui características interessantes, como o baixo custo e boa viabilidade técnica. Outro aspecto relevante é a existência de poucos trabalhos realizados no Brasil voltado para obtenção e otimização deste metabólito em função de apresentar atividade anti-câncer e leishmanicida. Em função do grande potencial deste metabólito, o presente trabalho refere-se ao estudo de um processo biotecnológico para otimizar a produção do 5-hidroxi,2-hidroximetil- γ -pirona.

METODOLOGIA:

Foi avaliado o efeito da regulação por nitrogênio sobre a produção do metabólito através da modificação quantitativa das fontes de nitrogênio inorgânico presentes no meio de cultura. Utilizaram-se frascos de erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL de meio líquido: sacarose (60,0 gl-1), KH2PO4 (1,0 gl-1), MgSO4.7H2O (1,0 gl-1), FeSO4.7H2O (0,2 gl-1), variou-se as quantidades de NaNO3 e (NH4)2SO4 de tal forma que foram obtidas as seguintes relações carbono-nitrogênio (C/N): 50, 100, 150 e 200. Os meios de cultivo foram inoculados com 1,0 g de biomassa micelial (pellets) em cada frasco, estes foram mantidos em incubadora com agitação fixada em 120 rpm a 28 ºC. Alíquotas de 500 µL foram retiradas a cada 24 horas durante 384 horas e submetidas à análise quantitativa do HGP por espectrofotometria (269 nm) e consumo do substrato através da quantificação de açúcares retutores totais (método do ácido 3,5-dinitrosalicílico). Paralelo a isto, foi realizado o estudo do perfil de crescimento da biomassa, onde pesagens consecutivas foram realizadas com o objetivo de verificar sua relação com o consumo de substrato e a produção do metabólito. O pH inicial do meio utilizado foi estabelecido em 5,5. Durante todo o período de cultivo, não houve correção programada, sendo a variação do pH estabelecida pelo microorganismo segundo sua necessidade fisiológica. A extração do metabólito a partir do cultivo líquido liofilizado foi realizada com acetato de etila e metanol na mesma proporção, seguida por filtração da fase líquida e cristalização a 25 °C. A identificação do metabólito foi realizada comparando-se a amostra com a substância padrão através de Espectroscopia de Infravermelho e Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e Carbono 13, utilizando como solvente dimetil sufóxido (DMSO).

RESULTADOS:

O estudo da relação carbono/nitrogênio demonstrou uma produção máxima de 21,56 gl-1 após 264 horas de cultivo quando foi utilizada a relação C/N= 150, nas condições de cultivo estabelecidas. Para as outras relações, foram obtidos os respectivos valores na máxima produção: C/N=50 (4,18 gl-1) após 168 horas, C/N=100 (5,15 gl-1) após 168 horas e C/N=200 (12,08 gl-1) após 288 horas. A produção do metabólito secundário foi influenciada diretamente pela regulação da fonte de nitrogênio. Foi observado que o perfil de crescimento não apresentou a fase lag, evidenciando que o inóculo inicial utilizado (pellets) já apresentava coenzimas essenciais e constituintes celulares necessários para absorção dos nutrientes presentes no meio. Após 144 horas, o microorganismo entrou na fase estacionária, onde foi alcançada a produção máxima do metabólito. Observou-se que a produção do metabólito de interesse se tornou mais evidente a partir de 192 horas de cultivo, quando 79% da sacarose já havia sido consumida. Há evidências de que no período decorrido até o início da produção do metabólito, o microorganismo direcionou o seu mecanismo enzimático para produção de hidrolases e seqüencialmente de invertases com objetivo de metabolizar os monossacarídeos presentes na sacarose. Observa-se uma queda inicial do pH até 72 horas de cultivo, e a partir de 144 horas houve uma tendência para o pH fisiológico. O cálculo do rendimento da obtenção dos cristais foi realizado com base na massa dos cristais obtidos em relação à quantidade de sacarose utilizada no meio de cultura como substrato, alcançando-se um rendimento de 6,96 % m/m.

CONCLUSÃO:

Os resultados confirmaram que o processo biotecnológico estudado apresentou grande potencial para obtenção do metabólito de modo a gerar quantidades adequadas para os estudos de transformação e aplicação em escala piloto, entretanto a regulação carbono-nitrogênio deve ser observada com critério para que não haja excesso ou ausência de nitrogênio, podendo inferir nas vias metabólicas. Quanto à obtenção do metabólito, foi alcançada uma quantidade significativa a partir do cultivo de Aspergillus flavus, apresentando um bom potencial de transformação da sacarose comercial. De forma análoga, o procedimento de isolamento do metabólito demonstrou ser eficiente, haja vista o grau de pureza obtida, verificada através dos métodos físicos de análises que forneceram informações suficientes para certificar a autenticidade do metabólito produzido.

Instituição de Fomento: CNPQ, FAPESPA.

Palavras-chave: Aspergillus flavus, Gama-pirona, Metabólito secundário.