63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 6. Farmacologia - 3. Toxicologia

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA E DOS FATORES DE VIRULÊNCIA PRESENTES EM VENENOS DAS SERPENTES Bothrops alternatus E Bothrops jararaca

Andréia Cristina Gomes 1 Marta Regina Magalhães 2 José Rodrigues do Carmo. Filho 2 Rebeca Raissa Bezerra de Oliveira 1 Fabrícia Paula de Faria 1 Rosália Santos Amorim Jesuino 1,3

1. Laboratório de Biotecnologia de Fungos, ICB - UFG 2. Laboratório de Toxinologia, Pontifícia Universidade Católica de Goiás 3. Profa. Dra./Orientadora - Depto. de Bioquímica e Biologia Molecular, ICB - UFG

INTRODUÇÃO:

As infecções fúngicas invasivas têm aumentado drasticamente nas últimas três décadas, tendo se tornado uma importante causa de morbidade e mortalidade entre os pacientes imunocomprometidos. Este fato ocorre devido, entre outras causas, ao desenvolvimento, pelos fungos, de mecanismos de resistência aos antifúngicos disponíveis. Alguns fungos considerados importantes patógenos humanos, dentre eles Candida, têm se mostrado resistentes aos fármacos rotineiramente preconizados em casos de infecções fúngicas. Neste sentido, vários estudos têm sido realizados na busca de novos compostos com atividade antimicrobiana. Os peptídeos de venenos, por sua alta seletividade, têm provado que são úteis para estudos de comprovação de eficácia como agentes antifúngicos in vitro e in vivo. Desta forma este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antifúngica e os fatores de virulência presentes nos venenos das serpentes Bothrops alternatus e Bothrops jararaca. Estas duas espécies de serpentes pertencem à família Viperidae, sendo responsáveis por elevado número de acidentes ofídicos no Brasil.

METODOLOGIA:

Atividade antifúngica dos venenos bruto de B. alternatus, B. jararaca contra Candida albicans e Aspergillus niger foi realizada pelo teste de disco de difusão e de microdiluição em placa, este último foi realizado pela adaptação dos documentos M38-A e M27-A2 emitidos pelo National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Em função dos resultados encontrados pelo teste de microdiluição em placa a determinação de unidade formadora de colônia foi realizada apenas para C. albicans. Para avaliar os fatores de virulência presentes nos venenos bruto foram realizados: 1) Dosagem de proteínas pelo método de Bradford (1976); 2) Gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) para análise do perfil de proteínas de acordo com Laemmli (1970); 3) Determinação da atividade proteolítica segundo o método Lomonte e Gutierrez (1983); 4) Atividade antioxidante baseada no método de Brand-Willians (1995); 5) Atividade hemolítica segundo metodologia proposta por Gutiérrez et al. (1984); 6) Determinação da atividade coagulatória por meio de dois testes: TAP e TTPA, com kits Soluplatin e APPTTest ellágico, respectivamente; sendo ambos os kits do laboratório Wiener; 7) Atividade de fosfolipase A2 segundo método de Price et al. (1982) com modificações.

RESULTADOS:

Não foi observada atividade antifúngica dos venenos pelo método de disco de difusão, diferente do encontrado por outros autores para os venenos botrópicos. Entretanto, pelo método de microdiluição, foi verificada atividade antifúngica do veneno de B. jararaca contra o fungo C. albicans, em consonância com resultados descritos na literatura. Quanto aos fatores de virulência, foi identificada atividade proteolítica nos venenos do gênero Bothrops, sendo esta uma característica marcante da ação do veneno botrópico. Atividade hemolítica dos venenos foi baixa, assim como determinado em outros estudos; enquanto a atividade coagulatória foi elevada. Os venenos de B. alternatus e B. jararaca apresentaram baixa e ausente atividade de fosfolipase A2, respectivamente. Este resultado pode ser explicado pela presença de inibidores específicos desta fosfolipase, sugerindo que estes inibidores sejam os possíveis responsáveis pela baixa atividade encontrada em algumas peçonhas botrópicas. Não foi detectada atividade antioxidante nos venenos analisados. O perfil proteico de B. alternatus e B. jararaca foi semelhante, apresentando proteínas com massa molecular entre 30 e 66 kDa.

CONCLUSÃO:

Ensaios de microdiluição em placa do veneno bruto de B. jararaca evidenciaram inibição significativa do crescimento da levedura C. albicans, entretanto não inibiu o crescimento do fungo A. niger. O veneno de B. alternatus não inibiu o crescimento dos fungos estudados. Em ensaios de disco de difusão destes venenos contra C. albicans e A. niger, os venenos não apresentaram atividade antifúngica, demonstrando baixa sensibilidade deste método em relação ao teste de microdiluição. A contagem de unidade formadora de colônia foi realizada na presença dos venenos de B. jararaca, inibindo a formação de colônias de C. albicans em 98,41%. Os venenos apresentaram alto teor proteico; elevada atividade proteolítica e coagulatória, baixa atividade hemolítica e atividade antioxidante ausente. Os venenos de B. alternatus e B. jararaca apresentaram atividade de fosfolipase A2 baixa e ausente, respectivamente. Observou-se por análise do perfil proteico dos venenos submetidos à eletroforese semelhanças entre os perfis dos venenos botrópicos.

Palavras-chave: Atividade antifúngica, Gênero Bothrops, Fatores de virulência.