63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 1. Biologia Molecular

Caracterização de Plasmídeos Isolados de Salmonella enterica

Lays Costa Marques 1 Renata Vieira Bueno 2 Ivan Torres Nicolau Campos 1 Luiz Artur Mendes Bataus 4

1. Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás - UFG 2. Faculdade de Fármacia – UFG 3. Prof. Dr./Orientador – Instituto de Ciências Biológicas - UFG

INTRODUÇÃO:

O gênero Salmonella pertence a família Enterobacteriaceae e compreende bastonetes gram-negativos que tem como habitat o trato gastrintestinal de homens e animais. Atualmente, há mais de 2400 sorotipos de Salmonella, dos quais um grande número é capaz de causar toxiinfecção alimentar – o que justifica a preocupação de órgãos responsáveis pela saúde pública com a ubiquidade da Salmonella e com os efeitos decorrentes de sua propagação em alimentos. A virulência da Salmonella é bastante complexa envolvendo fatores que podem localizar em elementos genéticos transmissíveis, como os plasmídeos. Plasmídeos são moléculas circulares de DNA extra cromossomal que possuem replicação autônoma. Essas cópias de DNA extra cromossomais, podem possuir funções desconhecidas – sendo denominados crípticos, ou podem codificar proteínas que desempenhem funções nas células hospedeiras, dentre elas a resistência à antibióticos, produção de toxinas, e constituição de ilhas de patogenicidade. Através da manipulação genética de plasmídeos é possível transformá-los em vetores de interesse biotecnológico - vetores são agentes que facilitam a inserção de material exógeno dentro de uma célula hospedeira. Constituindo, portanto, ferramentas importantes no estudo da Biologia Molecular de Microrganismos.

METODOLOGIA:

Foram isoladas 14 amostras de Enteretidis a partir de carcaças de frango e inoculadas em meio Luria e incubadas à 37oC durante a noite. De cada amostra 1,5 mL foram submetidas a mini-extração de plasmídeos. O DNA plasmidial extraído foi analisado por eletroforese em gel de agarose 1%. Os plasmídeos extraídos foram denominadas pRVB1 e pRVB2. Para dar início a caracterização, foi realizada a digestão com diferentes enzimas de restrição. Os plasmídeos foram digeridos com a enzima PstI, sendo subclonados no plasmídeo pUC18 digerido com a mesma enzima. Os plasmídeos resultantes dessa subclonagem foram utilizados para transformar células de E. coli DH5α. O plasmídeo pRVB2/pUC18 foi digerido e o fragmento correspondente ao plasmídeo pRVB2 foi purificado e ligado ao fragmento de 1,1 Kb do plasmídeo pUCK4, que codifica o gene de resistência a kanamicina. O pRVB2k foi submetido à sequenciamento. Estas sequências foram utilizadas para realizar uma busca por homologia utilizando o programa BLAST (Genbank). Para obtenção da sequência completa do pRVB2 foram desenhados novos primers baseados nas sequências dos plasmídeos pGY1 e pSL254, essas sequências foram alinhadas utilizando o programa Clustal X. Os ensaios de estabilidade plasmidial foram realizados por mais de 240 gerações.

RESULTADOS:

Para testar se os plasmídeos originais possuíam a capacidade de se replicar autonomamente em células de E. coli, os plasmídeos foram digeridos com enzima de restrição PstI e ligados ao gene de resistência a kanamicina purificado do plasmídeo pUC4K. Este fragmento foi então purificado a partir do gel de agarose. Para a inserção do gene de resistência a kanamicina nos plasmídeos pRVB1 e pRVB2 previamente digeridos com PstI realizou-se um sistema de ligação com a enzima T4 DNA ligase. Em seguida foi feita a transformação de células E. coli DH5α utilizando comomaterial exógeno o sistema de ligação citado. Foi testada a sua estabilidade nessa célula e mais de 90% das células viáveis no quinto dia apresentavam o plasmídeo pRVB2 mostrando que esse plasmídeo apresenta uma grande estabilidade em células de E. coli. O plasmídeo recombinante pUC18/pRVB2 foi submetido a sequenciamento, as sequências obtidas foram utilizadas para fazer umas busca por homologia utilizando o programa BLAST, foi encontrada homologia com os plasmídeos: pSL254 isolado de S. enterica subsp. enterica serovar Newport str. SL254; pGY1 isolado de S. Paratyphi , apresentando 99% de identidade. Visando obter a sequência completa do pRVB2 foram desenhados 8 primers que serão utilizados para o sequenciamento.

CONCLUSÃO:

O Plasmídeo pRVB2 pode ser considerado estável em células de E.coli uma vez que e mantido nas células por ate 5 dias (mais de 240 gerações) sem pressão seletiva. A sequência parcial do pRVB2 foi utilizada para realizar uma busca, entrou-se homologia com os plasmídeos: pSL254 isolado de S. entérica subsp. entérica serovar Newport str. SL254; pGY1 isolado de S. paratyphi. O plasmídeo pRVB2 apresentou 99% de identidade com esses plasmídeos. A análise das sequências desses plasmídeos mostrou que eles codificam poucas proteínas. Foram preditas 04 e 03 proteínas respectivamente. Como esses plasmídeos apresentam uma elevada identidade, possuem tamanhos semelhantes e aparentemente codificam proteínas hipotéticas conservadas, e de se esperar que o pRVB2 apresente uma sequência semelhante a sequência desses plasmídeos. De posse da sequência completa poderemos estudar a relação evolucionária desses plasmídeos entre si, bem como com outros plasmídeos de Enterobacteriaceas. Conhecendo a sequência completa poderemos desenhar primers para introduzir sítios para diferentes enzimas de restrição. Esses novos sítios de restrição irão permitir manipular geneticamente o pRVB2, de tal forma a desenvolver um vetor com interesse biotecnológico.

Palavras-chave: Plasmídeos, Samonella enterica, Vetor biotecnológico.