63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 6. Bioquímica

Glutationilação de proteínas em um modelo de melanoma

NÍVEA MARIA ROCHA MACEDO 1,3 LARA ZIMMERMANN 2 ROGER CHAMMAS 2 JOSÉ CÉSAR ROSA 3

1. SETOR DE GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR, INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE - UFAL 2. LABORATÓRIO DE ONCOLOGIA EXPERIMENTAL, FACULDADE DE MEDICINA – USP 3. CENTRO DE QUÍMICA DE PROTEÍNAS, DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR E BIOAGENTES PATOGÊNICOS, FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO - USP

INTRODUÇÃO:

O estresse oxidativo é uma situação em que a homeostase celular é alterada devido à produção excessiva de espécies reativas de oxigênio/nitrogênio (ROS/RNS) e/ou prejuízos na defesa celular antioxidante, que conduzem a dano molecular, disrupção da sinalização redox e do controle celular. A glutationilação de proteínas é considerada um mecanismo de regulação redox, cujas funções incluem a direta e espontânea limpeza de radicais livres e remoção de peróxido de hidrogênio. Diversas doenças humanas têm sido associadas com a diminuição dos níveis de glutationa no sangue. Por exemplo, a taxa sanguínea de glutationa está significantemente diminuída em pacientes com câncer de cólon e mama, comparado com indivíduos saudáveis. Assim, o objetivo do presente trabalho foi observar se existem diferenças nos níveis de glutationilação entre linhagens células normais e células de melanoma. Para isso, foi estudado o perfil de glutationilação protéica de 3 linhagens celulares, uma derivada de melanócitos denominada Melan-A e duas linhagens de melanoma derivadas de Melan A, denominadas TM1 e TM5.

METODOLOGIA:

As células foram submetidas a um procedimento de extração protéica por meio do uso do tampão uréia 7,7 M, tiouréia 2,2 M, CHAPS 4,4 %, tris-HCl 10 mM, ortovanadato de sódio 1 mM e coquetel de inibidores de proteases 10%. Em seguida foi feita a quantificação das proteínas presentes nos extratos pelo método de Bradford e separação destas por SDS-PAGE. Para realização de ensaios de western blotting com o anticorpo anti-glutationa, foi realizada a eletrotransferência dos géis de SDS-PAGE para membranas de nitrocelulose e reveladas por colorimetria, para que fosse possível a visualização direta do blotting. As imagens das membranas provenientes dos ensaios de western blotting foram captadas por um scanner de alta resolução do tipo Image Scanner (GE Healthcare). As imagens no formato TIF sofreram análise densitométrica com o auxílio do programa ImageMaster 6.0 (GE Heathcare). Com base no percentual de intensidade das bandas, as imagens foram convertidas em gráficos, os quais representam a quantificação relativa. As bandas do gel de eletroforese correspondentes à marcação pelo anticorpo anti-glutationa nas membranas de western blotting foram excisadas, submetidas à digestão por tripsina e identificadas por espectrometria de massas.

RESULTADOS:

O Western blotting revelou 8 bandas contendo proteínas glutationiladas. Foi observado que as bandas 4, 7 e 8 apresentaram aumento da glutationilação nas linhagens tumorais em relação à não-tumoral. Isso sugere que o estado pró-oxidativo no qual essas células tumorais se encontram, poderia induzir aumento nos níveis de glutationilação protéica. Contudo, foi observado nas bandas 1, 2, 3 e 5 diminuição de glutationilação nas linhagens tumorais. Essas bandas foram submetidas à proteólise por tripsina e identificação por espectrometria de massas. Grande parte das proteínas encontradas pode ser agrupada nas seguintes classes: citoesqueleto, enovelamento protéico e ligação a ácidos nucléicos. No nosso estudo, nas bandas protéicas 2 e 3 foram identificadas as seguintes 4 HSPs. A regulação redox da atividade destas proteínas pode ser uma resposta fisiológica ao estresse oxidativo relevante para a maioria dos processos relacionados a doenças.

CONCLUSÃO:

De acordo com nossos resultados, nas bandas 2 e 3, nas quais foram encontrados membros da família HSP, parece ocorrer diminuição da glutationilação protéica nas linhagens tumorais. Isso pode sugerir que essas proteínas estariam mais susceptíveis à oxidação e que este evento pode estar associado à progressão tumoral no melanoma.

Palavras-chave: MELANOMA, PROTEÔMICA, GLUTATIONILAÇÃO.