63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 6. Bioquímica

Análise de proteínas fosforiladas em melanoma murino

NIVEA MARIA ROCHA MACEDO 1,3 LARA ZIMMERMANN 2 ROGER CHAMMAS 2 JOSÉ CÉSAR ROSA 3

1. SETOR DE GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR, INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE - UFAL 2. LABORATÓRIO DE ONCOLOGIA EXPERIMENTAL, FACULDADE DE MEDICINA – USP 3. CENTRO DE QUÍMICA DE PROTEÍNAS, DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR E BIOAGENTES PATOGÊNICOS, FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO - USP

INTRODUÇÃO:

A atividade de muitas proteínas é modulada por meio da adição covalente de modificadores ou por meio de clivagem proteolítica. Modificações pós-traducionais podem afetar o turnover, localização, atividade ou interações. Fosforilação, acetilação, metilação, glicosilação e ubiquitinilação estão entre as modificações pós-traducionais mais comuns. Além disso, as modificações pós-traducionais de proteínas são aspectos da regulação celular que podem funcionar como alvos para a terapia de doenças como o câncer. Essa doença pode desenvolver-se a partir da desregulação de proteínas envolvidas nas respostas celulares ao ambiente. Sabe-se que a resposta celular nas primeiras horas após radiação é regulada por modificações pós-traducionais de proteínas efetoras como as tirosinoquinases, que atuam mediando a transdução intracelular de sinais. Portanto, a identidade, magnitude e o tempo em que ocorre a fosforilação protéica podem fornecer um ambiente rico para a identificação de alvos terapêuticos que distinguem células de melanoma das células adjacentes normais do tecido. Assim, o presente trabalho realizou a análise de fosforilação protéica em 3 linhagens celulares, uma derivada de melanócitos (Melan-A) e duas linhagens de melanoma derivadas de Melan A, denominadas TM1 e TM5.

METODOLOGIA:

As linhagens celulares foram submetidas a um procedimento de extração protéica por meio do uso do tampão uréia 7,7 M, tiouréia 2,2 M, CHAPS 4,4 %, tris-HCl 10 mM, ortovanadato de sódio 1 mM e coquetel de inibidores de proteases 10%. Em seguida foi feita a quantificação das proteínas presentes nos extratos pelo método de Bradford. As proteínas presentes nos extratos protéicos foram precipitadas na razão de 1:1 com uma solução de clorofórmio:metanol (1:1). Em seguida, para os ensaios de enriquecimento de fosfopeptídeos, amostras contendo 900 µg de proteínas foram re-dissolvidas em 40 µL de tampão de lise contendo CHAPS 0,1% e uréia 8 M. Bicarbonato de amônio foi utilizado para ajustar o pH da solução para 8,0. As proteínas foram, então, submetidas à digestão enzimática por tripsina durante 22 horas a 37°C. Para o enriquecimento de fosfopeptídeos, foram utilizadas as técnicas de precipitação com fosfato de cálcio e Cromatografia de Afinidade por Metal (IMAC). Os fosfopeptídeos foram submetidos à separação por cromatografia líquida em fase reversa em nano-HPLC UFLC-Prominence (Shimadzu Biotech, Japão) e identificados por espectrometria de massas.

RESULTADOS:

Foram identificadas por espectrometria de massas 223 fosfoproteínas. Destas 223 fosfoproteínas identificadas nas três linhagens celulares, 28 foram comuns a todas as três, 28 fosfoproteínas foram identificadas somente em TM1 e TM5, apenas 4 fosfoproteínas foram comuns à Melan-A e TM1 e 6 foram comuns a Melan-A e TM5. Foi observado que 169 fosfopeptídeos identificados contêm fosforilação em Ser ou Thr e, portanto, representam a maioria dos fosfopeptídeos detectados. Além disso, a maioria deles contém apenas um sítio, enquanto 15 sítios foram identificados em Tyr. Este resultado é completamente coerente com outros estudos similares descritos na literatura, uma vez que se estima que mais de 90% das fosforilações em células eucarióticas ocorrem em Ser e Thr.

CONCLUSÃO:

A investigação realizada neste trabalho contribuiu para o estabelecimento de uma metodologia proteômica para o estudo de uma modificação pós-traducional e também contribuiu para a caracterização de fosfoproteínas em um modelo de melanoma murino.

Palavras-chave: MELANOMA, PROTEÔMICA, FOSFORILAÇÃO DE PROTEÍNAS.