63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 3. Enzimologia

Imobilização e estudos cinéticos da enzima N-acetil-beta-D-glucosaminidase extraída do camarão marinho Litopenaeus schmitti em Dacron ferromagnético

Paula Simone Ortiz Barros 1 Themis Taynah da Silva Santana 1 Roberta Luciana do Nascimento Godone 1 Luiz Roberto Diz de Abreu 1 Luiz Bezerra de Carvalho Júnior 2 Luciana Duarte Martins da Matta 1

1. Depto de Bioquímica - UFRN 2. Prof. Dr. - Depto de Bioquímica - UFPE

INTRODUÇÃO:

O camarão é de grande importância comercial para o estado do Rio Grande do Norte, onde encontramos diversos tipos de espécies. Dentre estas, a escolhida para realização de estudos, Litopenaeus schmitti. Para isto utilizou-se o cefalotórax do camarão, porção normalmente descartada. Para a imobilização da enzima foi proposto o Dacron ferromagnético como suporte, este também é conhecido como PET. Na literatura ainda não existem relatos da imobilização de glicosaminidases voltadas para a modificação química de polissacarídeos. Por isso, imobilizou-se a N-acetil-beta-D-glucosaminidase (NAG), extraída do camarão, com vistas ao estudo da sua cinética enzimática, podendo vir a servir como ferramenta molecular na elucidação de estrutura química de glicoconjugados, de di e/ou oligossacarídeos e de polissacarídeos, como ainda para a produção de oligossacarídeos com potenciais atividades farmacológicas.

METODOLOGIA:

O cefalotórax do camarão Litopenaeus schmitti foi homogeneizado em tampão acetato de sódio 0,1 M pH 5,0 centrifugado e fracionado em três etapas: FI, FII e FIII, onde FIII apresentou maior atividade, sendo submetida à cromatografia de troca iônica, DEAE-biogel. As frações que apresentaram maior atividade foram reunidas. O Dacron ferromagnético foi ativado com glutaraldeído para posterior imobilização da enzima (NAG). Esta foi reunida ao suporte por 14h sob agitação. Todos os experimentos foram realizados utilizando-se o PNF-N-acetil-beta-D-glucosaminídeo como substrato. A temperatura ótima da NAG imobilizada(NAGI) foi determinada ensaiando-a em temperaturas variadas. Experimentos de estabilidade térmica foram feitos pré-incubando a NAGI por 30 min a temperaturas variadas sem o substrato e posterior ensaio em temperatura ótima. O número de reutilizações foi conhecido ensaiando-se a NAGI por diversas vezes seguidas. O pH ideal foi obtido ensaiando-se a NAGI em pHs variados. Os valores de Km foram obtidos sob incubação em diferentes concentrações do substrato. Posteriormente a NAGI foi incubada com clexane por 45°C, por 48h, submetidas à eletroforese em gel de agarose em caixa refrigerada a 4°C, sob tensão de 8 V/cm durante 60 min. O gel foi seco e em seguida corado.

RESULTADOS:

A Fração FIII demonstrou maior atividade de N-acetil-beta-D-glucosaminidase (NAG), sendo, portanto, escolhida para a realização dos testes. A enzima foi eluída da cromatografia de troca iônica na fração 0,2 molar de NaCl. Nos resultados cinéticos, a NAG apresentou temperatura ótima de 55°C ao passo que a NAGI apresentou uma faixa entre 45 e 55°C. A NAGI mostrou estabilidade térmica maior que a solúvel, potencializando sua atividade a 60°C. A NAG, mostrou atividade ótima entre pH 5,0-6,0, e a imobilizada revelou maior estabilidade em pHs mais ácidos, 3,0-5,0. Valores de Km foram calculados em 0,51 e 9,9 mM para a enzima solúvel e imobilizada, respectivamente, isto ocorre, possivelmente porque alguns sítios ativos durante a imobilização não ficam expostos. A NAGI pôde ser reutilizada por 12 vezes seguidas sem perda de atividade. O suporte conferiu à enzima uma maior estabilidade, pois impede a ação de possíveis inibidores e/ou proteases ativadas com a variação de temperatura e pH. Na eletroforese não se observou nítida degradação da clexane, provavelmente, de acordo com a literatura, esta pode ter se ligado aos sítios ativos da enzima, atuando como inibidor.

CONCLUSÃO:

A fração F-III (50-80%) apresentou maior atividade da enzima N-acetil-beta-D-glucosaminidase (NAG). A NAG, quando covalentemente imobilizada em partículas magnéticas (Dacron), resultou em um derivado insolúvel detentor das seguintes propriedades: Facilmente removível do meio reacional por meio de um campo magnético; retenção de parte da atividade específica da enzima solúvel; reutilizações seguidas sem perda de atividade; temperatura ótima para catálise do substrato igual ao da enzima solúvel (55°C); mais termoestável que a enzima solúvel; Maior estabilidade em pHs ácidos, divergindo da forma solúvel; Constante de Michaelis-Menten (Km) maior em comparação à sua forma solúvel indicando que a enzima quando imobilizada perde afinidade pelo substrato. Sobre os testes com a heparina comercial: Pode ter acontecido uma possível inibição da Clexane sobre a enzima. A enzima se manteve firmemente ligada ao suporte e a reutilização demonstra o potencial do sistema enzima-Dacron para aplicações práticas.

Palavras-chave: N-acetil-beta-D-glucosaminidase, Imobilização, Vertebrado marinho.