63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 5. Genética Vegetal

CARACTERIZAÇÃO DE cDNAS IDENTIFICADOS EM BIBLIOTECAS SUBTRATIVAS DE TOMATEIRO

Isabel Andrade Lopes de Sousa 1 Renata Kaline Souza Estevam 2 Katia Castanho Scortecci 3

1. Graduanda - LBMG; Depto. de Biologia Molecular e Genética da UFRN 2. Mestranda - LBMG; Depto. de Biologia Molecular e Genética da UFRN 3. Profa. Dra./Orientadora – LBMG;Depto. de Biologia Molecular e Genética da UFRN

INTRODUÇÃO:

O gênero Lycopersicon possui nove espécies que evoluíram em locais distintos. Diferente do tomateiro cultivado ( S. lycopersicon), a espécie S. pimpinellifolium, considerada como selvagem, é conhecida por possuir inflorescência com abertura simultânea de 15-30 flores, contendo desta forma, maior número de flores em relação ao cultivado S. lycopersicon e o modelo Micro-Tom. Apesar de sua relevância nutricional e valor econômico, até o momento sabe-se pouco sobre o processo de floração e frutificação em tomateiro. Considerando esta diferença entre a espécie considerada como selvagem e a domesticada é importante prospectar genes que possam estar associados com a produção de suas flores e consequentemente frutos, e que, futuramente, possam ser usados para otimização de sua produção agrícola. Para isto, foram construídas em nosso laboratório nove bibliotecas subtrativas de cDNA e dentre as sequências identificadas foi escolhida a OSMOTINA, gene expresso nesse gênero principalmente em resposta ao estresse abiótico, como alvo para uma análise in silico e filogenética. Enquanto outra seqüência, ARP (proteína reprimida por auxina), foi usada para a construção de cassetes de super-expressão em orientação senso e anti-senso e produção de transgênicos para posterior caracterização funcional.

METODOLOGIA:

Utilizando as sequências previamente identificadas nas bibliotecas subtrativas foram procuradas sequências com homologia à proteína OSMOTINA. Para análise in silico o E-value <1.0x10-15 foi utilizado como critério de exclusão. Os alinhamentos múltiplos foram realizados utilizando o programa ClustalW, com a caracterização de domínios funcionais. A construção da árvore filogenética foi através do programa PAUP 4.0 usando apenas as sequências homólogas cujos domínios eram funcionais. Para a construção dos cassetes de super expressão foi utilizado inicialmente o vetor pBC (Stratagene) contendo o promotor forte CaMV35S. Em seguida, pelo auxílio de endonucleases de restrição, a sequência ARP1 ligada ao promotor foi retirada deste vetor e inserida no vetor binário pPZP211 de modo a obter o cassete nas orientações senso e anti-senso. As orientações dos cassetes foram confirmadas por PCR, digestão com enzimas de restrição e seqüenciamentos dos potenciais clones. Estes cassetes foram transformados por eletroporação na Agrobacterium tumefaciens LBA4404 e posteriormente em plantas de S. lycopersicon cv. Micro-Tom.

RESULTADOS:

Os resultados da análise in sílico permitiram observar 13 domínios protéicos funcionais, todos da super-família TAUMATINA. A proteína OSMOTINA de tomateiro apresentou identidade entre 70% e 41% com proteínas de A.thaliana, de 44% e 39% com proteínas de S. tuberosum, 65% e 63% de identidade protéica com Medicago Trunculata, 65% com T. sativa e, por fim, identidades de 63% e 48% com Zea mays. Na árvore gerada para OSMOTINA não houve separação entre as proteínas de monocotiledônea e de dicotiledôneas, nem mesmo entre as famílias, indicando uma possível evolução do gene através de duplicações antes mesmo de haver a separação entre estes grupos. A OSMOTINA mostrou-se como grupo irmão da proteína de Arabidopsis thaliana com a qual possuía 70% de identidade. O clado formado por ambas está inicialmente associado ao ramo composto pela proteína de Z. mays e a de T. sativa, essa diversificação em diferentes ramos aponta para prováveis caminhos evolutivos alternativos. Paralelamente, os cassetes de super-expressão de ARP foram obtidos nas orientações senso e anti-senso e, logo, foram usados para infectar os tomateiros.

CONCLUSÃO:

OSMOTINA e a TAUMATINA fazem parte do grupo PR5, composto pelas proteínas relacionadas ao metabolismo de defesa vegetal, o que corrobora com a homologia entre os domínios apesar de sua a conservação não ser de 100%. A maior proximidade filogenética com uma das sequências protéicas da A.thaliana condiz com estudos anteriores que demonstram homologias funcionais entre diversos genes dessas duas plantas, inclusive de floração. Como essa proteína foi obtida através de bibliotecas subtrativas de ápices meristemáticos é interessante realizar a sua caracterização funcional in vivo, dando destaque a sua atuação em nível molecular, pois se sabe que esse gene está ligado a maiores florações, inclusive em situações de estresse hídrico. O sucesso tido na construção de cassetes de super-expressão com ARP e no desenvolvimento de seus transgênicos nos leva ao passo seguinte na caracterização funcional, a observação de sua atuação no crescimento vegetativo e reprodutivo desses indivíduos e de suas consecutivas gerações.

Palavras-chave: ARP, OSMOTINA, Construção de cassetes de super-expressão.