63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 9. Imunologia - 5. Imunologia

Avaliação da metaciclogênese in vitro de isolados de Leishmania spp: Influência na infecção de macrófagos humanos.

Ildefonso Alves da Silva Junior 1 Camila Imai Morato 1 Arissa Felipe Borges 1 Valeria B. L. Quixabeira 2 Miriam Cristina Leandro Dorta 3 Fátima Ribeiro Dias 4

1. Aluno(a) pós-graduação em Medicina Tropical e Saúde Publica/IPTSP/UFG 2. Biomédica Msc. - Instituto Goiano de Hematologia e Oncologia 3. Profa. Dra. - Instituto Patologia Tropical e Saúde Pública - UFG 4. Profa. Dra./Orientadora - Depto de Imunologia - IPTSP/UFG

INTRODUÇÃO:

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é causada por protozoários Leishmania e acomete preferencialmente a pele e/ou as mucosas oral e nasofaríngea. Durante o ciclo de transmissão da doença, as formas promastigotas procíclicas crescem no intestino do inseto vetor e após sofrerem metaciclogênese, transformam-se em formas promastigotas metacíclicas, que infectam células do sistema fagocíticomononuclear do hospedeiro. As formas promastigotas em culturas axênicas são principalmente formas procíclicas quando na fase logarítmica do crescimento e metacíclicas, na fase estacionária do crescimento. As diferentes formas clínicas da LTA dependem de aspectos genéticos/moleculares dos parasitos e da resposta imune do hospedeiro. O objetivo deste estudo foi avaliar a metaciclogênese de seis isolados de Leishmania spp em culturas in vitro e a influência da metaciclogênese na infecção de macrófagos humanos.

METODOLOGIA:

Foram avaliados três isolados de L. (V.) braziliensis: MHOM/BR/2006/EFSF e MHOM/BR/2003/IMG, referidos como EFSF6 e IMG3, respectivamente, isolados de pacientes com leishmaniose cutânea e MHOM/BR/2006/PPS6m, referido como PPS6, isolado de paciente com leishmaniose mucosa. Um isolado de L. (L.) amazonensis, MHOM/BR/2006/MAB, referido como MAB6, obtido de paciente com leishmaniose cutâneo difusa, também foi avaliado. Todos os isolados foram cultivados em meio Grace´s contendo 20% de soro fetal bovino, a 26ºC. As curvas de crescimento foram realizadas por meio de quantificação dos parasitos diariamente durante 12 dias; após 2, 6 e 10 dias de cultivo, foi realizada a purificação das formas metacíclicas da cultura, utilizando a lectina de Bauhinia purpurea (para L. (V.) braziliensis) e o anticorpo 3A1-La (para L. (L.) amazonensis). Os parasitos totais e purificados, foram analisados por citometria de fluxo para quantificação das formas metacíclicas na cultura. Macrófagos humanos, ativados ou não com interferon gama (IFNγ) e lipopolissacarídeo (LPS), foram infectados com os parasitos de diferentes dias de cultivo (1:1, parasito:macrófago). Os dados foram analisados por teste pareado de Wilcoxon ou por ANOVA Kruskal-Wallis, estabelecidas diferenças signficantes quando p < 0,05.

RESULTADOS:

Os perfis das curvas de crescimento in vitro foram similares para todos os isolados, sendo detectada a fase estacionária do crescimento a partir do quarto dia de cultura, coincidindo com o aumento no número de formas metacíclicas na cultura, identificadas por citometria de fluxo (2º e 6º dias vs 10º dia, p < 0,05, n = 4). Nos ensaios de infecção in vitro dos macrófagos humanos, o índice de infecção de macrófagos foi maior quando estes foram infectados com parasitos do 6º (IMG3 e MAB6) e 10º (IMG3, MAB6 e PPS6m) dias de cultura, coincidindo com o aumento de formas metacíclicas nas culturas destes isolados, que ocorre durante a fase estacionária do crescimento, entretanto,o tratamento dos macrófagos com INFγ e LPS reduziu o índice de infecção, especialmente naquelas culturas infectadas com parasitos do 2º e 6º dia de cultura, sendo que somente houve uma redução no índice de infecção nas culturas infectadas com parasitos do 10º dia quando foi usado o isolado PPS6m. Estes resultados demonstram que os isolados IMG3 e MAB6 são mais resistentes aos mecanismos microbicidas dos macrófagos quando estão presentes maiores quantidades de formas metacíclicas na cultura (10º dia), enquanto as formas metacíclicas do isolado PPS6m apresentam fatores intrínsecos que lhes tornam mais suscetíveis aos mecanismos microbicidas dos macrófagos.

CONCLUSÃO:

Em conclusão, esses dados demonstram que a metaciclogênese de L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis ocorre tardiamente nas culturas axências, com um predomínio de formas metacíclicas no 10º dia de cultura, coincidindo com o aumento da capacidade dos parasitos de infectar macrófagos humanos. Os dados sugerem que parasitos que causam a forma mucosa (PPS6m) podem ser mais suscetíveis à atividade microbicida de macrófagos do que aqueles que causam a forma cutânea (IMG3, MAB6) da LTA, enfatizando diferenças entre parasitos causadores de diferentes formas clínicas da LTA e a necessidade de estudar a metaciclogênese destes isolados para conseguir melhores índices de infecção de macrófagos in vitro.

Palavras-chave: Leishmania, metaciclogênese, macrófago.