63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 13. Parasitologia - 5. Protozoologia de Parasitos

AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DAS TÉCNICAS UTILIZADAS PARA O DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA

Anna Karoline Aguiar Fleuri 1 Nathália Ferreira Lima 2 Ledice Inácia de Araújo Pereira 3 Sebastião Alves Pinto 4 Fátima Ribeiro-Dias 5 Miriam Leandro Dorta 6

1. Estudante de graduação em Biomedicina, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás 2. Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás 3. Hospital de Doenças Tropicais Anuar Auad de Goiânia, Goiás 4. Instituto Goiano de Hematologia e Oncologia, Goiânia, Goiás 5. Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás 6. Profa. Dra/ Orientadora - Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás

INTRODUÇÃO:

A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma doença infecto-parasitária cujo agente etiológico é o protozoário do gênero Leishmania. As manifestações clínicas no homem podem variar desde uma simples lesão cutânea até lesões destrutivas da mucosa ou formas viscerais, como conseqüência de uma complexa resposta imunológica do hospedeiro e diversidade da espécie envolvida na infecção. Os procedimentos para o diagnóstico da doença são baseados no tipo de apresentação clínica, história epidemiológica, testes parasitológicos e métodos imunológicos. Em muitos casos, estes testes consomem muito tempo, apresentam baixa sensibilidade ou requerem condições para manutenção de culturas de parasitos. Uma identificação precisa da espécie do parasito infectante é importante, uma vez que as espécies do subgênero Viannia complexo braziliensis são responsáveis também por lesões mucosas mutilantes e o conhecimento do agente etiológico, bem como um diagnóstico precoce, são essenciais para um tratamento e controle apropriado. O objetivo deste estudo foi comparar a sensibilidade das técnicas laboratoriais utilizadas para o diagnóstico da LTA com a reação em cadeia da polimerase associada à análise de polimorfismo de comprimento dos fragmentos de DNA (PCR-RFLP), utilizado para o diagnóstico molecular.

METODOLOGIA:

Pacientes clinicamente suspeitos da forma cutânea (LC, n = 31) ou da forma mucosa (LM, n = 6) de LTA foram atendidos no ambulatório de endemias do Hospital de Doenças Tropicais Anuar Auad (HDT) em Goiânia, Goiás no período de janeiro de 2009 a junho de 2010. Para o diagnóstico laboratorial foi feito o isolamento do parasito em cultura in vitro - em meio de cultura Grace, e in vivo em camundongos geneticamente deficientes de interferon-γ, exame histopatológico seguido de análise imunohistoquímica, intradermorreação de Montenegro (IRM), imunofluorescência indireta (IFI) e PCR-RFLP. Para a análise por imunohistoquímica foram realizados cortes do tecido do local da lesão, os cortes foram incluídos em parafina e incubados com anticorpos policlonais de coelho anti-Leishmania spp. seguido por tratamento com estreptoavidina-biotina-peroxidase e contrastado com hematoxilina. O DNA genômico foi extraído de fragmentos de biópsias utilizando-se um kit de extração e foi feita uma PCR utilizando iniciadores específicos para amplificar uma região conservada dos minicírculos do kDNA de Leishmania de 120 ou 116 pares de bases. Os produtos da PCR foram submetidos à digestão enzimática usando a endonuclease de restrição Hae lll.

RESULTADOS:

Entre os 37 pacientes atendidos no ambulatório de endemias do HDT, em 33 foi confirmada LTA, desses 29 apresentaram leishmaniose cutânea e quatro apresentaram leishmaniose mucosa. Os casos confirmados de LTA foram detectados com sensibilidades similares pela IRM (73,1%), PCR (72,7%), e análise histopatológica (60,7%). A IFI, o isolamento in vitro e o isolamento in vivo apresentaram sensibilidades de 36,6%, 12,1% e 9,1%, respectivamente. Para a forma mucosa a PCR mostrou-se mais sensível em relação ao exame histopatológico detectando 50% dos casos, enquanto a análise histopatológica não detectou nenhum. Dentre estes casos a IRM foi positiva em três (75%) pacientes, mostrando que esta é uma técnica útil para triagem dos casos de LTA. A PCR-RFLP identificou 91,7% dos parasitos como Leishmania (Viannia) - 20 pacientes apresentaram a forma cutânea e dois a forma mucosa. Enquanto que em 8,3% dos pacientes que apresentaram a forma cutânea foi identificada a espécie L. (L.) amazonensis. Os resultados obtidos sugerem que a PCR-RFLP foi mais sensível para diagnosticar a forma mucosa de LTA do que a maioria dos métodos utilizados.

CONCLUSÃO:

Dos 37 pacientes suspeitos em 33 foi confirmada a LTA por diferentes métodos de diagnóstico. A IRM, a PCR e a análise histopatológica quando comparadas apresentaram sensibilidades similares, já a IFI e os isolamentos tanto in vitro quanto in vivo apresentaram baixas sensibilidades. Entre os 33 casos confirmados de LTA, a PCR diagnosticou 24 casos. Em todas estas amostras foi possível realizar a distinção do subgênero de Leishmania através da digestão enzimática (PCR-RFLP), destas 20 amostras pertenciam ao subgênero Leishmania (Viannia) e duas foram caracterizadas como Leishmania (L.) amazonensis. A PCR-RFLP mostrou-se uma técnica específica e sensível para o diagnóstico da LTA, além de identificar os subgêneros de Leishmania apresentou grande valor no diagnóstico dos casos de leishmaniose mucosa. A identificação do gênero/espécie do parasito envolvido é importante para auxiliar na rotina de tratamento, definição da epidemiologia da doença no Brasil e para compreender a sua patogenia.

Palavras-chave: Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), Leishmania sp., PCR-RFLP.