63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 3. Enzimologia

AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DA ENZIMA N-ACETILGLICOSAMINIDASE POR ISOLADOS DE Trichoderma spp.

Ana Carolina Rezende 1 Cirano José Ulhoa 2

1. Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás – UFG 2. Prof. Dr./ Orientador-Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás – UFG

INTRODUÇÃO:

O gênero Trichoderma compreende um grupo de fungos filamentosos encontrados no solo e em raízes de várias espécies de plantas. São antagonistas a outros fungos, sendo utilizados como agentes de biocontrole dos fitopatógenos de interesse na agricultura. Fungos do gênero Trichoderma, principalmente T. harzianum, são conhecidos como bons produtores das enzimas 1,3/1,6 glucanases, quitinases e N-acetilglicosaminidase. Desde 1996 que o grupo do laboratório de enzimologia (ICB/ UFG) tem concentrado esforços no sentido de contribuir para o entendimento de micoparasitismo e controle biológico. Considerando a importância das enzimas do sistema quitinolítico no mecanismo de micoparasitismo e o potencial de utilização de fungo do gênero Trichoderma em controle biológico, estamos propondo neste projeto fazer uma avaliação da capacidade de produção da enzima N-acetilglicosaminidase produzida pelos seguintes isolados de Trichoderma: 05/01 e 356/01.

METODOLOGIA:

Os isolados de Tricoderma 05/01 e 356/01, da coleção do laboratório de Enzimologia/UFG, foram mantidos em repiques periódicos em meio MYG e estocados a 4°C. Para a produção de N-acetilglicosaminidase, 107 esporos dos isolados foram inoculados no meio TLE (suplementado de quitina e glicose como fonte de nitrogênio e carbono) em seguida incubados em shakers a 28°C por 48 horas a rotação de 140 rpm. A concentração de proteína nas amostras foi determinada pelo método de Bradford (1976). A atividade de N-acetilglicosaminidase foi determinada nas condições de reação feitas de acordo com Yabuki et al., (1986). Posteriormente, a N-acetilglicosaminidase do melhor produtor foi caracterizada quanto à termoestabilidade, temperatura e pH ótimo, efeito da variação da concentração do substrato e efeito de açúcares. Todos os procedimentos foram realizados no laboratório de Enzimologia do Instituto de Ciências Biológicas/UFG.

RESULTADOS:

Utilizando como substrato (pNP-NAG), a enzima N-acetilglicosaminidase (NAGase) apresentou uma atividade proporcional ao tempo de incubação. Aumentando a velocidade de reação ao passar do tempo. A enzima apresentou também uma atividade proporcional à concentração deste substrato, tendo sua velocidade de reação aumentada á medida que a concentração de pNP-NAG aumenta. Porém, a atividade aumentará até que a concentração de substrato seja saturante. A NAGase produzida pelos isolados de Tricoderma 05/01 e 356/01 apresentaram melhores atividades de reação a 60°C e 50°C respectivamente. Mostrando que os valores de temperatura ótima das NAGases variam, porém se mantém próximos. Somente a NAGase do isolado de Tricoderma 356/01 foi caracterizada quanto a sua termoestabilidade, pH ótimo, e o efeito de açúcares. Já que este isolado apresentou uma maior atividade enzimática em relação ao isolado 05/01. Pode ser observado que a enzima é bastante estável, pois apresentou estabilidade em sua atividade até 60°C. A enzima manteve uma atividade relativa maior que 85% na faixa de pH entre 3,0 e 5,0 e apresentou pH ótimo de 3,0. Em relação ao efeito de açúcares na atividade de NAGase, esta foi fortemente inibida por Glicosamina, ativada por Glicose e inibida em teor moderado por N-acetilglicosamina.

CONCLUSÃO:

Os resultados obtidos mostraram que a produção de N-acetilglicosaminidase depende da fonte de carbono e nitrogênio utilizada. Analisando os dois isolados estudados, de uma forma geral eles apresentaram uma boa atividade nas fontes de carbono e nitrogênio (quitina e glicose). Contudo, como o isolado 356/01 apresentou maior atividade de NAGAse que o isolado 05/01, aquele foi então usado para estudos mais detalhados. Pode-se concluir que a enzima possui um pH ótimo de 3,0 e uma temperatura ótima de 50 °C. Podendo ser encontrados na literatura valores diferentes. Observou-se que a atividade de NAGAse é proporcional ao tempo de incubação com o substrato e a concentração deste substrato. Sendo que essa atividade permanecerá constante após concentrações limites de substrato. Os açúcares N-acetilglicosamina e Glicosamina apresentaram um efeito inibidor na atividade de N-acetilglicosaminidase.

Palavras-chave: Enzimas hidrolíticas, N-acetilglicosaminidase, Trichoderma spp.