63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 1. Biologia Molecular

AVALIAÇÃO DE PROTOCOLOS PARA EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO DE SANGUE BOVINO

Bruno do Amaral Crispim 1 Jackeline Schultz Soares 2 Camila Magalhães da Cunha 2 Leonardo Oliveira Seno 2 Alexeia Barufatti Grisolia 3

1. Faculdade de Ciências Biológicas e Ambientais – UFGD 2. Faculdade de Ciências Agrárias – UFGD 3. Profa. Dra./Orientadora - Faculdade de Ciências Biológicas e Ambientais – UFGD

INTRODUÇÃO:

Estudos básicos sobre técnicas de extração de DNA são de extrema importância para o sucesso de trabalhos científicos no campo da biologia molecular. Diferentes métodos de extração de DNA têm sido utilizados e estão bem estabelecidos para diferentes espécies, entretanto, dependendo das condições laboratoriais e em função da variabilidade existente na composição das amostras, são necessárias algumas modificações e adaptações nos protocolos. Atualmente, amostras de DNA genômico extraído de animais de interesse zootécnico, são muito importantes e podem ser utilizadas para vários fins, como por exemplo, diagnóstico clínico de doenças, teste de paternidade, melhoramento genético e estimativa do valor genético de animais. Pesquisar métodos alternativos de extração de DNA que possam ser rápidos, práticos, de menor custo, livres de contaminação e de toxicidade e eficazes no que tange à quantidade, qualidade e possibilidade de amplificação por PCR, do DNA extraído, possibilitam a aplicação desta técnica em vários estudos. Este estudo teve como objetivo avaliar protocolos de extração de DNA, determinando a sua quantidade, qualidade e a viabilidade de amplificação de DNA genômico pela técnica da PCR.

METODOLOGIA:

Foram utilizadas amostras de sangue de 10 animais, provenientes da Agropecuária Jorge Ferreira - Fazenda Tuju Puitan, município de Iguatemi – MS. Foram coletados 4,5 mL de sangue da veia jugular e armazenados em tubos vaccutainer com EDTA potássico. Esse material foi acondicionado em geladeira até seu processamento. A extração de DNA foi realizada no Laboratório de Biotecnologia aplicada à Produção Animal, Faculdade de Ciências Agrárias da Universidade Federal da Grande Dourados (FCA/UFGD), cinco dias após a colheita de sangue. As amostras foram submetidas à extração de DNA utilizando dois protocolos diferentes: Protocolo de extração de DNA de sangue total e outro Protocolo de Extração de DNA a partir de leucócitos. As amostras de DNA extraídas a partir de leucócitos e sangue total foram submetidas à Reação em Cadeia pela Polimerase para o éxon 2 do gene da leptina bovino. Os fragmentos amplificados e o controle negativo foram separados por eletroforese em gel de agarose a 2,0%, 120 V, por 40 minutos. Foram estimadas média aritmética e o desvio padrão para os resultados de quantificação de DNA obtido e os resultados dos dois protocolos foram submetidos à análise de variância e, quando significativos (p<0,05), ao teste de médias de Tukey.

RESULTADOS:

Houve diferença estatisticamente significativa entre ambos os parâmetros analisados, tanto na quantidade quanto na qualidade (p < 0,01) do DNA obtido pelos dois métodos. A concentração de DNA extraído com o protocolo de extração a partir de sangue total apresentou média de 1,66 µg/μl, com razão variando de 1,17 a 1,67. Para as amostras extraídas com o protocolo de DNA a partir de leucócitos, o rendimento médio foi de 5,90 µg/μl, e a razão variaram entre 1,24 e 1,48. Os níveis de pureza, representados pela razão também diferiram significativamente (P = 0,001). Entretanto o protocolo de extração de DNA de sangue total (Média = 1,36) apresentou maior eficiência neste parâmetro, que o protocolo de extração de DNA a partir de Leucócitos (Média = 1,00). Considerando-se o tempo utilizado para os dois protocolos de extração, o que utilizou sangue total mostrou-se um método de rápido e eficiente (aproximadamente 2h e 30 min.), quando compa¬rado ao do protocolo de Extração de DNA de leucócitos que leva maior tempo, cerca de 8h e 30min. Determinou-se por meio de avaliação eletroforética do DNA que a obtenção do mesmo a partir do protocolo de sangue total de bovinos é uma alternativa viável, uma vez que apresentou tão boa qualidade quanto o extraído com o protocolo de leucócitos.

CONCLUSÃO:

Com base nos resultados obtidos e considerando-se as condições em que o trabalho foi desenvolvido, pôde-se concluir que, a quantidade e a qualidade do DNA genômico obtido em ambos os protocolos analisados foram consideradas satisfatórias para a realização da PCR e que esses dois métodos testados neste estudo têm grande potencial para extrair DNA genômico de boa qualidade. No entanto, o protocolo de extração utilizando sangue total se demonstrou maior rapidez e melhor qualidade do DNA extraído.

Palavras-chave: Biologia Molecular, Teste de Extração, PCR.