63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 3. Enzimologia

INTERVENÇÃO DA RESISTÊNCIA DE CÉLULAS LEUCÊMICAS A QUIMIOTERÁPICOS ATRAVÉS DO SILENCIAMENTO DA LMWPTP UTILIZANDO NANOTUBOS DE CARBONO

Juliana Karasawa Vieira de Souza 1 Carmen Veríssima Ferreira 2

1. Curso de Farmácia, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas/SP 2. Profª. Drª. / Orientadora, Depto. De Bioquímica, Instituto de Biologia, UNICAMP, Campinas/SP

INTRODUÇÃO:

A Leucemia Mieloide Crônica (LMC) é uma forma de neoplasia hematológica que está francamente em ascensão no mundo, sendo tratável apenas com quimioterapia, portanto, a multirresistência constitui um obstáculo importante na terapêutica. Uma opção seeria utilizar formas alternativas de tratamento, entre elas, a terapia gênica com siRNA, que tem como objetivo reduzir a expressão de um determinado gene. Para maior especificidade e redução de possíveis efeitos colaterais, ao invés de diretamente induzir a morte celular pode-se quebrar a resistência aos agentes quimioterápicos com o silenciamento de responsáveis por este fenótipo, e, entre eles, está a LMWPTP. Entretanto, o siRNA por si só não adentra a célula, necessitando de um carreador, como o nanotubo de carbono (NT), que, por se inerte, tem grande potencial como carreador, o que se explora neste trabalho.

METODOLOGIA:

Cultura de células: células leucêmicas (K562/Lucena) em meio RPMI com 100UI/mL de penicilina, 100µg/mL de sulfato de estreptomicina e suplementação com soro fetal bovino (SFB) a 10%. Células são semeadas na densidade de 1x105 cél./mL e cultivadas em atmosfera umidificada, 5% CO2 a 37ºC. Determinação do efeito agudo dos NT: as células (2x105 cél./mL) foram incubadas com 100µg/mL de NT, que variam quanto à fonte de carbono, superfície e atmosfera de crescimento e funcionalização, após 24 horas, contou-se as células viáveis em câmara de Neubauer com Azul de Tripan. Transfecção de iRNA ERK1 com NT e kit comercial: No dia da transfecção, as células foram plaqueadas a 2x105 cél./100µL. A seguir adicionou-se o complexo de transfecção: iRNAERK e NT (750ng de siRNA ERK1 com 0,010mg/mL de NT e incubados por 10 minutos, o volume foi completado para 100µL com meio RPMI sem soro) ou kit de transfecção (Qiagen: preparado conforme a bula) a cada poço. Após 6h, adicionou-se 400µL de meio RPMI suplementado. Após 24, 48 e 72h, checou-se o silenciamento por contagem de células viáveis. Avaliação da interação entre iRNA e NT: 750ng do siRNA para a ERK com 0,010mg/mL do NT e incubados por 10 min e submetidos a eletroforese em gel de agarose (2%) com marcador de 1kb e brometo de etídio.

RESULTADOS:

Determinação do efeito agudo dos NT: foi observada uma flutuação em torno do controle negativo em torno de 20%, o que é considerado dentro da faixa normal para a linhagem K562/Lucena. Houve também pouca distorção da morfologia celular e praticamente nenhum efeito de lise ou apoptose, sendo estes considerados casos isolados. Avaliação da interação entre iRNA e NT: após 1 hora de corrida, as bandas correspondentes aos nanotubos e ao controle negativo se alinharam. Isso indica que a interação entre os nanotubos não foi capaz de resistir à voltagem empregada no protocolo-padrão de corrida em gel de agarose (120V). Sugerimos que seja uma interação meramente física, uma vez que não temos evidência para sugerir uma interação dipolo-dipolo ou tipo força de dispersão. Efeito de transfecção dos NT contra kit comercial: as formulações designadas como NT1A, NT1novo e NT2 obtiveram os melhores resultados em termos de células, com uma rampa inicial de inclinação muito baixa ou inexistente e tendendo à queda após 48 horas (quando começa a se esgotar o pool de ERK acumulada, uma das responsáveis pela manutenção da atividade proliferativa).

CONCLUSÃO:

Os nanotubos não apresentaram efeito citotóxico sobre as células Lucena; a interação dos nanotubos utilizados com o iRNAERK foi fraca; aparentemente, as formulações designadas como NT1A, NT1novo e NT2 apresentaram maior eficiência de carreamento do iRNA, quando o número de células foi avaliado em função do tempo. Os dados apresentados indicam o potencial dos nanotubos como carreadores de iRNA. No entanto, será importante otimizar as formulações para uma melhor eficiência de transfecção.

Palavras-chave: Leucemia Mieloide Crônica, siRNA, Nanotubos de Carbono.