63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 1. Biologia Molecular

IDENTIFICAÇÃO DOS COMPONENTES MOLECULARES DA SINALIZAÇÃO CELULAR RHO – ACTINA DE Trypanossoma cruzi UTILIZANDO METODOLOGIA DE DUPLO-HÍBRIDO EM Saccharomyces cerevisae

Stephanie Serafim de Carvalho 1 Mariana Juliani do Amaral 1 Mario A.C. Silva-Neto 3 Marcelo Alex Carvalho 1 Ulisses G. Lopes 2 Luiz Dione B. de Melo 1,2

1. IFRJ, Campus Maracanã, Laboratório de Genética Molecular 2. UFRJ, CCS, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho 3. UFRJ, CCS, Instituto de Bioquímica Médica

INTRODUÇÃO:

O agente etiológico da Doença de Chagas, o Trypanossoma cruzi alterna seu ciclo evolutivo de vida entre um hospedeiro vertebrado e um invertebrado, apresentando formas tripomastigotas sanguícolas e amastigotas no hospedeiro vertebrado, e formas epimastigotas e tripomastigotas metacíclicos no hospedeiro invertebrado. Para se diferenciar, o protozoário passa por profundas modificações morfológicas e metabólicas, indicando a presença de vias de transdução de sinal, no qual se supõe que estão envolvidas proteínas do citoesqueleto de actina e GTPases monoméricas. T. cruzi possui o ortólogo de actina e proteínas de ligação a actina evolutivamente conservadas(1) e um ortólogo da família Rho de GTPases monoméricas, denominado TcRho1(2). Porém, correlações das funções atribuídas a TcRho1 com interações com proteínas efetoras e a própria actina ainda se encontram incipientes. Este trabalho se se propõe a estabelecer um possível perfil de interação dos ortólogos de Rho e actina com as proteínas do parasito através de um sistema de duplo-híbrido em Saccharomyces cerevisae.

METODOLOGIA:

A metodologia escolhida implica na produção das proteínas híbridas. Estão sendo utilizados dois vetores: pTL e pGAD424. O primeiro vetor, pTL, contem uma região codificante para o domínio de ligação ao DNA LexA (LexABD) e o repórter nutricional LEU2, que permite uma seleção auxotrófica de levedura em meio ausente de leucina. O segundo vetor, pGAD424, contem uma região codificante para o domínio de ativação do DNA GAL4 (GAL4AD) e o repórter nutricional TRP1, que permite uma seleção auxotrófica de levedura em meio ausente de triptofano. Ocorrendo interação in vivo entre estas proteínas, o duplo-híbrido formado será capaz de ativar a transcrição de marcadores genômicos como HIS3 e LacZ (β-galactosidase), e, na presença de um substrato cromogênico para LacZ, poderemos visualizar as leveduras expressando os marcadores mediante a prévia formação do duplo-híbrido.

RESULTADOS:

No vetor pTL realizaram-se as clonagens das regiões codificantes de duas iscas: Rho e Actina. No vetor pGAD424 foi feita a clonagem da região codificante de Rho para teste pareado com a construção pTL-Actina. A expressão em Saccharomyces cerevisaeL40 das iscas Actina-LexABD, Rho-LexBD e Rho-GAL4AD não prejudicou o crescimento em conseqüência de uma possível toxicidade. Ademais, o vetor pGAD424 teve seu sítio de clonagem modificado para permitir a transferência dos fragmentos codificantes oriundos de uma biblioteca de cDNA normalizada de T. cruzi(3). Esta modificação correspondeu à inclusão de três adaptadores distintos para os três possíveis quadros de leitura para fusão com GAL4AD, e sítios de restrição para EcoRI e BamHI nas extremidades, e NotI e XhoI na região mediana. Estes sítios foram necessários para confirmar a modificação e para subclonagem da biblioteca de cDNA. Estamos estimando a eficiência da subclonagem da biblioteca, assim, realizar o acasalamento da população de leveduras haplóides expressando a biblioteca em fusão com LexABD com leveduras haplóides expressando as iscas Rho ou actina em fusão com Gal4AD. Essa abordagem com as cepas haplóides L40, AH109 e Y187 visa à obtenção de leveduras diplóides expressando ambos duplo-híbridos.

CONCLUSÃO:

Esperamos em breve identificar leveduras diplóides contendo híbridos funcionais através da seleção auxotrófica com HIS3 e expressão de LacZ (beta-galactosidase). A identificação do seleto grupo de proteínas ancestrais, que atuam como parceiras para as proteínas Rho e actina e outras intermediárias irá ajudar a desvendar essa via de sinalização celular em T. cruzi, propiciando informações para um melhor entendimento da fisiologia celular e possível auxílio no controle da patogênese provocada por esse parasito.

Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, GTPase, Actina.