63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 1. Biologia Molecular

Otimização de uma armadilha de captura de proteases, baseada no uso de inibidor protéico imobilizado em resina

Ana Camila Oliveira Freitas 1 Carlos Priminho Pirovani 2

1. Discente - Depto de Ciências Biológicas - UESC 2. Prof.Dr./Orientador - Depto de Ciências Biológicas- UESC

INTRODUÇÃO:

Fitocistatinas são inibidores de cisteíno-proteases produzidas pelas plantas como reguladores da atividade catalítica dessas enzimas. Cisteíno-proteases são uma classe de enzimas com massa entre 23 e 30 kDa que usam resíduos de cisteína para a atividade catalítica contra proteínas. Estas enzimas são produzidas pelas plantas contra o ataque de patógenos e insetos, além de participarem de processos fisiológicos como a morte celular programada, germinação de sementes e turnover. Na biblioteca de cDNA da interação Theobroma cacao-Moniliophthora perniciosa foram identificadas cisteíno-proteases que podem participar da interação planta-patógeno. Este trabalho teve por objetivo a otimização de um método de captura de proteases estabelecido no Laboratório de Proteômica da UESC, como forma de identificar as cisteíno-proteases envolvidas diretamente nos processos fisiológicos de infecção.

METODOLOGIA:

Quatro inibidores de cisteíno proteases, denominados TcCYS1, TcCY2, TcCYS3 e TcCYS4, foram identificados a partir da bibliotecas de cDNA geradas em nosso laboratório e clonadas em células de E.coli. Os quatro possuem os motivos clássicos de inibição de cisteíno-proteases e TcCYS1 e TcCYS4 contém a região carboxi terminal estendida com a presença da sequência SNSL, com potencial atividade inibitória de proteases do tipo leguminas. A partir da obtenção dos clones a proteína foi induzida e purificada por cromatografia de afinidade por coluna de níquel. A obtenção das proteínas puras possibilitou a execução de teste de inibição de papaína por TcCYS4 e a região carboxi (TcCYS4 Del) contra o substrato cromogênico BApNA. Testes de inibição utilizando TcCYS4 e TcCYS4 Del e pH de reação entre 2,0 e 11,0 foram realizados para verificar a interferência do pH no potencial inibitório da proteína recombinante. Por fim, a proteína TcCYS4 foi imobilizada em resina de sefarose ativada com CNBr para capturar cisteíno-proteases de extratos foliares de cacau.

RESULTADOS:

O método de purificação foi eficiente e possibilitou a execução de teste de inibição de papaína por TcCYS4 e a região carboxi (TcCYS4 Del) contra o substrato cromogênico BApNA, mostrando que região carboxi não apresenta potencial inibitório mas consegue capturar proteases. Os testes mostraram que a proteína TcCYS4 foi eficiente em inibir papaína na faixa de pH entre 5,0 e 8,0 e em pHs abaixo de 4,0 o potencial inibitório de TcCYS4 é reduzido. O método de armadilhas para proteases foi eficiente em isolar cisteíno-proteases de folhas senescentes de cacau já que foram identificadas proteases relacionadas a senescência e estresse, alem de encontrar enzimas não estudadas e hipoteticas.

CONCLUSÃO:

O método de captura de proteases se mostrou uma forma eficiente de recuperar proteínas de interesse de extrato foliar de cacau e pode ser uma ferramenta para o estudo de proteínas relacionadas com o patosistema Theobroma cacao-Moniliophthora perniciosa.

Palavras-chave: Inibidor de protease, Theobroma cacao, cistatina.