63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 1. Biologia Molecular

ANÁLISE DA ESPECIFICIDADE DOS INICIADORES DIRECIONADOS PARA O GENE gaoB DA GALACTOSE OXIDASE PARA A IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE Fusarium verticillioides E Fusarium subglutinans

Camila Agnes Lumi Abe 1 Carla Bertechini Faria 1 Dauri José Tessmann 2 Ione Parra Barbosa-Tessmann 3

1. Depto. de Bioquímica - UEM 2. Prof. Dr. - Depto. de Agronomia - UEM 3. Profa. Dra./ Orientadora - Depto. de Bioquímica - UEM

INTRODUÇÃO:

O Brasil é atualmente o terceiro maior produtor mundial de milho, sendo o Estado do Paraná o maior produtor. Fusarium verticillioides e Fusarium subglutinans são patógenos de milho e causam diminuição do lucro da produção e da qualidade dos grãos produzidos, pois causam deterioração dos grãos e são produtores de micotoxinas. Estes patógenos são transmitidos pelas sementes, o que contribui para a disseminação a grandes distâncias. A detecção da presença destes patógenos nas sementes de milho é importante. Previamente, os genes gaoB da galactose oxidase de F. verticillioides e de F. subglutinans foram utilizados para o desenho de iniciadores para a reação da polimerase em cadeia (PCR). Estes iniciadores possuem alta especificidade para o DNA genômico destas espécies e não amplificam qualquer fragmento de DNA em reações com o DNA genômico de isolados de diferentes espécies e Fusarium e de outros gêneros de fungos. No entanto, pouco se sabe sobre a especificidade destes iniciadores em relação a outros fungos encontrados comumente em sementes de milho. Portanto, o objetivo deste trabalho foi o de testar a especificidade destes iniciadores com o DNA genômico de fungos obtidos de sementes de milho.

METODOLOGIA:

Sementes de milho coletadas de janeiro a outubro de 2009, em alguns dos principais Estados produtores do País, foram incubadas em meio de batata dextrose ágar, pH 4,5, suplementado com penicilina e estreptomicina, por um período de cinco a sete dias a 25oC, com fotoperíodo de 12 horas. Colônias de fungos crescendo sobre as sementes e com características diferentes de F. verticillioides foram utilizadas para isolamento monospórico. Os isolados de Aspergillus e Penicillium foram classificados com base nas características morfológicas em meios seletivos. Os outros isolados foram identificados molecularmente por meio da amplificação e sequenciamento de um fragmento do gene do rRNA e pesquisa BLAST em bancos de dados. A identificação específica de Fusarium graminearum e de Aspergillus flavus foi realizada com reações de PCR e pares de iniciadores específicos. As reações de PCR consistiram de 25 μL de uma mistura de tampão da enzima, MgCl2, Platinum Taq DNA polimerase, dNTPs, iniciadores e DNA genômico e elas foram realizadas com 25 ciclos de 1 min e 30 seg a 94oC, 1 min e 30 seg a 57-62oC e 2 min a 72oC. As reações foram analisadas em gel de agarose.

RESULTADOS:

Os isolados obtidos pertenciam a alguns dos gêneros de fungos comumente associados com sementes de milho como Fusarium, Mucor, Aspergillus, Cladosporium, Epicocum e Penicillium. As espécies Fusarium graminearum e Aspergillus parasiticus também foram encontradas entre os isolados. A especificidade dos iniciadores direcionados para o gene gaoB de F. verticillioides e de F. subglutinans foi confirmada em reações de PCR com o DNA genômico dos isolados encontrados, pois estes iniciadores não amplificaram qualquer fragmento de DNA nestas reações.

CONCLUSÃO:

Os resultados indicam que os iniciadores direcionados para o gene gaoB de F. verticillioides e de F. subglutinans têm um potencial para o diagnóstico molecular da presença de destes microrganismos em sementes de milho.

Palavras-chave: Fusarium verticillioides, Fusarium subglutinans, Diagnóstico molecular.