63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 10. Microbiologia - 1. Biologia e Fisiologia dos Microorganismo

ATIVAÇÃO E ENVOLVIMENTO DE VIAS SINALIZADORAS CELULARES DURANTE A INFECÇÃO PELO Vaccinia virus BELO HORIZONTE

Paloma Caroline Ferreira Augusto 1 Jonas Dutra Albarnaz 1 Paulo César Peregrino Ferreira 1 Erna Geessien Kroon 1 Cláudio Antônio Bonjardim 1

1. Departamento de Microbiologia - Universidade Federal de Minas Gerais 2. Departamento de Microbiologia - Universidade Federal de Minas Gerais 3. Departamento de Microbiologia - Universidade Federal de Minas Gerais 4. Departamento de Microbiologia - Universidade Federal de Minas Gerais 5. Dr./Orientador - Departamento de Microbiologia - Universidade Federal de Minas Gerais

INTRODUÇÃO:

Durante a infecção, os vírus usurpam a maquinaria celular e evadem às respostas antivirais do hospedeiro com vistas à eficiente geração e disseminação da sua progênie. O Vaccinia virus (VACV) é o protótipo da família Poxviridae, caracterizando-se por ser um vírus grande (360×270×250nm) de morfologia complexa e genoma de DNA fita dupla (~200kb), cuja replicação ocorre inteiramente no citoplasma da célula hospedeira. Dado o seu grande genoma, o VACV codifica diversas proteínas envolvidas na evasão imune e interação vírus-hospedeiro, mas também manipula a ativação de vias sinalizadoras celulares, a fim de tornar o ambiente intracelular mais propício à sua multiplicação e disseminação. No Brasil, infecções por VACV caracterizam-se como zoonose emergente, acometendo roedores, bovinos, equinos e humanos. Desta forma, as amostras brasileiras de VACV constituem uma valiosa ferramenta ao estudo da interação VACV-hospedeiro. Este trabalho avaliou a ativação e o envolvimento de vias sinalizadoras celulares durante a infecção pelo VACV Belo Horizonte (VBH), isolado durante um surto de “varíola murina” no Centro de Bioterismo da UFMG, em comparação ao VACV Western Reserve (VACV-WR), amostra de referência.

METODOLOGIA:

Para avaliar a ativação de vias sinalizadoras celulares (MEK/ERK, JNK, p38 e PI3K/Akt), extratos protéicos totais de células A31 (fibroblastos embrionários de camundongos Balb/C, 3T3) infectadas ou não pelo VBH ou VACV-WR a MOI (multiplicidade de infecção) 10, em diferentes tempos, foram submetidos a fracionamento eletroforético seguido de transferência para membrana de nitrocelulose. Após bloqueio de sítios inespecíficos, as membranas foram incubadas com anticorpo primário, seguido de incubação com anticorpo secundário conjugado à peroxidase e revelação. O controle interno das quantidades de proteínas foi feito pelo uso do anticorpo primário anti-β-actina. Para avaliar o efeito de inibidores farmacológicos de vias sinalizadoras celulares sobre a multiplicação do VBH, em comparação ao VACV-WR, células A31 foram pré-tratadas por 30min com os inibidores farmacológicos e então infectadas pelo VBH ou VACV-WR, a MOI 10, em presença do inibidor durante toda a infecção. Após 24h, as células mais o meio foram congelados e descongelados três vezes e os sobrenadantes clarificados contendo as partículas virais foram titulados em células BSC-40 (células epiteliais de rim de macaco verde africano).

RESULTADOS:

Durante a infecção de células A31, a ativação de MEK/ERK, JNK, p38 e PI3K/Akt foi temporalmente regulada por ambos os vírus. Entretanto, a inibição farmacológica de MEK (UO126) e PI3K (LY294002) não afetou significativamente a multiplicação do VBH (≤50%), ao contrário do observado para VACV-WR. Já a inibição de p38 (SB202190 e SB203580) reduziu a progênie do VBH em 90%, mas não afetou o VACV-WR, ressaltando as diferenças biológicas marcantes entre estas duas amostras de VACV a despeito da similaridade genética. Estudo prévio do laboratório mostrou que em presença do inibidor de PI3K, a síntese de proteínas tardias do VACV-WR é bastante inibida ou completamente abolida. Entretanto, em presença de LY294002, a multiplicação do VBH, assim como a síntese de proteínas virais tardias foram apenas retardadas, mas não inibidas. Durante a infecção pelo VACV-WR, a via PI3K/Akt também desempenha um papel antiapoptótico, em conjunto com as diversas proteínas antiapoptóticas codificadas pelo vírus. Já durante a infecção pelo VBH, apoptose foi desencadeada independentemente da inibição de PI3K. Apesar disso, quatro genes sabidamente antiapoptóticos (B13R, E3L, F1L e N1L) não apresentaram polimorfismos no genoma do VBH quando comparados aos genes homólogos em VACV-WR.

CONCLUSÃO:

Em conclusão, estes dados indicam que a despeito da grande similaridade genética entre VBH e VACV-WR, estas duas amostras de VACV apresentam profundas diferenças biológicas que certamente refletem na patogênese destes vírus in vivo. Estudos estão em andamento para melhor investigar o papel da MAPK p38 para a biologia do VBH in vitro e in vivo.

Palavras-chave: Vaccinia virus, Vaccinia virus Belo Horizonte, Interação vírus-hospedeiro.