63ª Reunião Anual da SBPC

E. Ciências Agrárias - 1. Agronomia - 3. Fitossanidade

IDENTIFICAÇÃO E GENOTIPAGEM DE ESPÉCIES DE Fusarium EM GRÃOS DE MILHO ARDIDOS, MOFADOS E ASSINTOMÁTICOS POR PCR

Carolina Domingues de Souza 1 Cleiltan Novaes da Silva 1 Tatiane Cristina Albuquerque Alves 1 Dauri José Tessmann 2

1. Depto. de Agronomia, Universidade Estadual de Maringá – UEM 2. Prof. Dr./Orientador - Depto. de Agronomia – UEM

INTRODUÇÃO:

A presença de grãos com danos mecânicos, ardidos ou mofados deprecia a qualidade e o valor comercial do milho. A ocorrência de grãos ardidos e mofados é uma conseqüência de podridões que ocorrem na espiga, causadas por fungos presentes no campo, como Fusarium spp., dentre outros. A preocupação maior com espécies de Fusarium associadas a grãos de milho mofados ou ardidos deve-se ao alto potencial dessas espécies para a produção de micotoxinas, as quais podem causar danos à saúde de humanos e animais que consomem grãos e seus sub-produtos. Nos últimos anos diversos protocolos que empregam a reação em cadeia da polimerase (PCR) têm sido desenvolvidos para o auxílio na identificação de espécies desse gênero e também para a genotipagem (Niessen, 2008). Assim, existem protocolos baseados em PCR que utilizam iniciadores específicos que auxiliam a identificação das espécies F. verticillioides, (Mulè et al., 2004), e o complexo F. graminearum (Nicholson et al., 1998), e para a genotipagem para, 15-acetil-desoxinivalenol (15ADON) e nivalenol (NIV) (WARD et al., 2002); e fumonisinas (GONZÁLES-JAEN et al., 2004; SANCHEZ-RANGEL et al., 2005).

METODOLOGIA:

A partir der grãos de milho ardidos, mofados e assintomáticos obtidos de espigas no Paraná, obteve-se a coleção de isolados. Um montante de 200 grãos de cada amostra foi analisado pelo método do “Blotter Test” que foram desinfectados superficialmente, e incubadas a 20 ºC por 5 dias. Obteve-se culturas monospóricas de isolados de Fusarium que foram armazenados em eppendorf e Castellani para preservação e manutenção dos isolados. Para a identificação das espécies dos isolados, o micélio fúngico de cada isolado foi produzido em meio de cultura líquido, macerou-se o micélio em nitrogênio líquido pra a extração de DNA com o método CTAB. As amostras foram armazenadas a -20 ºC. Para as análises de PCR utilizou-se os protocolo estabelecido por Mulé et al. (2004) e Nicholson et al.(1998). A genotipagem dos isolados de F. graminearum, foi realizada com o protocolo de PCR multiplex desenvolvido por Ward et al. (2002) utilizando primers TRI3 e TRI12, e para a genotipagem dos isolados de F. verticilioides foi empregado o protocolo de Sanchez-Rangel et al. (2005) com o iniciador Fum53. As análises foram executadas em um termociclador. Os produtos da reação de PCR foram analisados em gel de agarose no Laboratório de Biotecnologia Vegetal, no câmpus da UEM.

RESULTADOS:

A análise de identificação de 30 isolados monospóricos para cada padrão de grãos mostrou que a única espécie associada a grãos ardidos e mofados foi F. verticillioides. Enquanto nos grãos assintomáticos, foram encontradas as espécies F. verticillioides e F. graminearum, nas proporções de 27/30 e 3/30, respectivamente. Os resultados obtidos estão de acordo com o relato de Bottalico (1998), segundo o qual a espécie de Fusarium que ocorrem com maior freqüência associada à espigas e grãos de milho sintomáticos ou não sintomáticos é F. verticillioides. A análise por PCR com iniciadores específicos para genótipos produtores de fumonisinas mostrou que todos os isolados F. verticillioides possuem o cluster de genes que codifica fumonisinas. O PCR multiplex para os três isolados de F. graminearum, utilizando o conjunto de iniciadores TRI3 e TRI12, produziu bandas com aproximadamente 610 e 670 pb, respectivamente, mostrando que os isolados são quimiotipos 15ADON. Não há informações relacionadas com genotipagem por PCR de F. graminearum oriundo de milho.

CONCLUSÃO:

Nos grãos ardidos e mofados encontrou-se apenas a espécie F. verticillioides, enquanto que nos grãos assintomáticos foram encontradas as espécies F. verticillioides (incidência de 90%) e F. graminearum (incidência de 10%). Todas as espécies F. verticillioides encontradas nas três amostras apresentam genes para a produção de fumonisina e os três isolados de F. graminearum encontrados em grãos de milho assintomáticos apresentam genes para a produção de 15-acetil-desoxinivalenol.

Palavras-chave: fungos, micotoxinas, Zea mays..