63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 1. Biologia Molecular

IDENTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DO GENE DE UMA PROTEÍNA ELICITORA DE DEFESA DE textoTrichoderma spp.texto

Rachel Silveira Freitas 1 Andrei Stecca Steindorff 1 Cirano José Ulhoa 1,2

1. Depto. de bioquímica e biologia molecular – UFG 2. Prof. Dr./Orientador

INTRODUÇÃO:

Espécies do gênero Trichoderma têm sido utilizadas como agentes de controle biológico contra diferentes tipos de fitopatógenos. Os mecanismos utilizados pelas espécies de Trichoderma contra esses fitopatógenos vão desde a competição por nutrientes, produção de antibióticos voláteis e não voláteis à produção de enzimas hidrolíticas. Em adição às suas capacidades micoparasíticas, muitas linhagens de Trichoderma são capazes de colonizar a raiz da planta e induzir resistência local e sistêmica contra o ataque de patógenos. Estudos definem três diferentes classes de compostos produzidos estes fungos que induzem resistência em plantas: proteínas com função enzimática, proteínas homólogas a proteínas codificadas por genes Avr e oligossacarídeos ou compostos de baixo peso molecular liberados da parede celular do fungo ou da planta por enzimas produzidas pelo Trichoderma. Como fungos micoparasitas do gênero Trichoderma já foram descritos como indutores de resposta de defesa e resistência sistêmica, o nosso grupo de pesquisa está interessado em analisar a interação Trichoderma spp./feijoeiro. Sendo assim, este trabalho visa identificar e avaliar a expressão do gene da proteína elicitora de defesa descrita em Hypocrea atroviridis em diferentes isolados de Trichoderma spp.

METODOLOGIA:

Esporos (1x107 mL-1) de Trichoderma spp. foram inoculados em frascos de 250 ml contendo 50 ml de meio. Para extração do RNA total, o micélio congelado foi macerado até a obtenção de um pó fino, este material foi utilizado na extração seguindo o protocolo padrão do Trizol (Invitrogen™). O RNA total extraído foi utilizado para síntese de cDNA utilizando a metodologia de RT-PCR ( invitrogen® - SuperScript IIITM). A análise de expressão do gene em estudo foi feita por real-time PCR. Os sistemas de amplificação de cDNA foram montados em um volume final de 20 ?L. A quantidade de cDNA, molde inicial, foi de 100ng. Os oligonucleotídeos específicos (Sm1 F- 5’ACGACGACGGCTCCCGGTCT 3’ / Sm1 R- 5’ TCCGATGTATGGGAAGCGAGGG 3’) foram utilizados na concentração de 2,5 µM. Foi utilizado kit MAXIMA® SYBR Green qPCR 2X máster mix. O ciclo de amplificação procedeu-se a 94°C por 10 minutos, seguido de anelamento e extensão a 60°C por 1 minuto perfazendo 40 ciclos. Para a normalização da expressão foi utilizado primers dos genes ß-actina (act F- 5’CGACAATGGTTCCGGTATGTGCAA3’/ act R- 5’ACGTAGGAGTCCTTCTGACCCATA3’) e a-tubulina (tubF-TATCTGCTACCAGGCTCCCGAGAA/tubR-5’ TGGTGTTGGACAGCATGCAGACAG3’).

RESULTADOS:

SEIDL e colaboradores (2006) identificaram uma pequena proteína chamada Epl1 como maior componente do secretoma de H. atroviridis quando crescido em glicose. Essa proteína também foi expressa em outras condições testadas e análise de sua sequência revelou ser membro de uma família de pequenas proteínas, as cerato-plataninas que têm sido descritas envolvidas na indução de resposta de defesa da planta. Com o objetivo de estudar a expressão dessa proteína (Epl1) em alguns isolados de Trichoderma spp., da Coleção Embrapa Arroz e Feijão, foram desenhados oligonucleotídeos baseado no gene de Epl1 de H. atroviridis. Estes oligonucleotídeos foram utilizados para amplificação do fragmento de interesse. Fizemos uma avaliação da expressão do gene da epl1 em diferentes isolados de Trichoderma spp. crescidos em meio contendo 1,5% de glicose. Dentre os isolados testados o 475/02 (T. harzianum) apresentou uma expressão pelo menos nove vezes maior que demais isolados quando crescido na presença da raiz de feijão. Resultados similares foram observados quando crescidos em meio contendo glicose 1,5% (expressão 58 vezes maior) e feijão (1,3 vezes maior)

CONCLUSÃO:

Com essa avaliação pudemos observar que a expressão do gene da proteína em estudo foi significativamente maior no isolado 475/02, nas três condições testadas. O gene estudado já está sendo clonado. Em análises futuras esse isolado será testado em campo para avaliação da resposta de defesa produzida no feijoeiro após interação com este fungo.

Palavras-chave: Trichoderma spp., Proteína elicitora, Análise de expressão.