63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 5. Genética Vegetal

DESENVOLVIMENTO DE MARCADORES MICROSSATÉLITES PARA O BURITI (Mauritia flexuosa, ARECAEAE) COMO FERRAMENTA PARA O ESTUDO DA FILOGEOGRAFIA E FLUXO GÊNICO.

Ana Maria Olivatti 1 Suelen Gonçalves Rabelo 1 Mariana P C Telles 1 Maria Emília M T Walter 2 Rosane Garcia Collevatti 1

1. Inst.de Ciências Biológicas, UFG, LGBIO 2. Depart.de Ciência da Computação, UNB

INTRODUÇÃO:

A Mauritia fexuosa, conhecida como buriti, é uma palmeira definidora dos ambientes de vereda, tanto pela importância ecológica quanto pela alta densidade em comparação com as poucas espécies arbóreas que ali ocorrem. Essa espécie serve como fonte de alimento e como local de abrigo e de reprodução para aves e mamíferos, podendo ser considerada como uma espécie chave no ambiente de veredas. Dessa forma a redução populacional ou até mesmo a extinção do buriti pode causar sérios problemas para a fauna regional. Microssatélites consistem em pequenas seqüências com um a seis pares de base repetidas em série e fornecem os marcadores moleculares mais polimórficos como resultado de mecanismos como crossing-over desigual e derrapagem da enzima polimerase durante a replicação ou reparo do DNA. O entendimento dos padrões de distribuição e diversidade dos microssatélites pode ajudar na compreensão da evoluçao dessas regiões nos genomas de diferentes espécies. O buriti é uma palmeira que ocorre nas regiões alagadas e úmidas do Cerrado, denominadas veredas. Tem importância ornamental, farmacológica, alimentícia e estratégica na preservação da fauna, pois seus frutos são fonte de alimentos para aves e mamíferos. O objetivo desse trabalho é identificar como as regiões microssatélites estão distribuídas no genoma do buriti.

METODOLOGIA:

Para o desenvolvimento dos marcadores foi elaborada uma biblioteca genômica shotgun utilizando o vetor plasmidial pMOS Blue para clonagem. Em seguida, o DNA plasmidial dos clones foi extraído utilizando CTAB 2% e seqüenciado em seqüenciador automático (ABI3100). As seqüências geradas foram analisadas no site “http://citosina.biomol.unb.br/papirus” e a busca das regiões repetitivas foi feita pelo software WebSat. Estas buscas foram realizadas para um mínimo de 6 repetições nos mononucleotídeos e quatro para os di-, tri-, tetra-, penta- e hexanucleotídeos. Os microssatélites que apresentaram tamanho e características adequadas para o desenho dos iniciadores foram sintetizados e submetidos a PCR. Os produtos da amplificação dos locos desenvolvidos foram submetidos à eletroforese vertical em gel desnaturante de poliacrilamida 6% e corados com nitrato de prata. O tamanho dos alelos foi determinado por comparação com um padrão de DNA Ladder 10 pb.

RESULTADOS:

Foram seqüenciados 1440 clones, contendo 113.138 bases seqüenciadas com valores de Phred ≥20, onde foi possível encontrar 137 regiões microssatélites. Dentre essas os motivos de repetição variaram de dois a seis pares de bases, sendo microssatélites perfeitos ou imperfeitos, dos quais: 113 continham mononucleotídeos (82,4%), 12 dinucleotídeos (8,7%), 7 trinucleotídeos (5%), 3 tetranucleotídeos (2,1%) e 1 pentanucleotídeo (0,72%) e 1 hexanucleotídeo (0,72%). O mononucleotídeo G(n) foi o mais abundante seguido por T(n), A(n) e C(n) dentre os dinucleotídeos o mais presente foi A/T(n). Embora a existência dessas regiões não garanta o desenho de iniciadores em suas regiões flanqueadoras, nesse trabalho foram detectadas oito sequências que permitiram o desenvolvimento de marcadores microssatélites: AACCC(7), CT (9), AG(19), CAA(7), ATG(4), GAA(8)GAA(3)GA(12), GTC(4), CGC(5), GGGCCC(3). A temperatura de anelamento dos iniciadores variou entre 46°C e 60°C e a amplitude dos alelos variou entre 130 e 254 pares de bases. Como o esperado, os motivos de repetição maiores apresentaram uma freqüência bem mais baixa de ocorrência no genoma de buriti, porém esses foram os mais utilizados na síntese dos iniciadores. Embora oito iniciadores tenham sido desenvolvidos, esse pode ser considerado um número baixo quando comparado a maioria dos trabalhos desse tipo, onde normalmente muitos iniciadores são desenvolvidos já que há uma grande perca desses nas etapas de otimização e caracterização.

CONCLUSÃO:

Este tipo de estudo é necessário para entender a abundância diferencial das repetições sob o cenário evolutivo e possibilitar futuros estudos genético-populacionais.

Palavras-chave: buriti, microssatélite, ssr.