63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 3. Enzimologia

Propriedades de chaperona da proteína recombinante Tiorredoxina 1

Lorena Gonçalves Pires Landi 1 Lorena Cardoso Cintra 2 Denise da Silva Pinheiro 2 Kênya Silva Cunha 2 Fabrícia Paula de Faria 2 Rosália Santos Amorim Jesuino 3

1. Ciências Biológicas IFGoiano – Rio Verde 2. Instituto de Ciências Biológicas - Depto. de Bioquímica e Biologia Molecular – UFG 3. Profa. Dra./Orientadora - Instituto de Ciências Biológicas -Depto. de Bioquímica e Biologia Molecular – UFG

INTRODUÇÃO:

A tiorredoxina (TRX) é uma tiol proteína pequena (~12 kDa) contendo um sítio ativo altamente conservado Cys-Gly-Pro-Cys e que forma uma classe de proteínas multifuncionais com atividade redox (redução-oxidação) encontrada ubiquamente desde procariotos até o homem. Esta proteína tem sido descrita como um eficiente antioxidante que protege as células contra o estresse oxidativo. Sabe-se que a TRX influencia quase todos os aspectos da função celular em células de mamíferos, tendo importantes implicações na saúde e na doença, o que tem tornado esta proteína um foco de extensas pesquisas em várias áreas. As TRXs também são capazes de interagir com um grande número de proteínas, apresentando propriedade de chaperona. Estudos realizados para avaliar a propriedade de chaperona da TRX mostram a eficiência desta proteína em estimular a renaturação de outras proteínas. Este trabalho tem como objetivo avaliar o papel de chaperona da proteína recombinante TRX1 (recTRX1) ao auxiliar a renaturação da enzima Glicoamilase.

METODOLOGIA:

O cDNA da PbTRX1 foi clonado no vetor de expressão pGEX-4T-3. Esse vetor foi introduzido em uma célula hospedeira Escherichia coli BL21. A expressão da recTRX1 foi induzida pelo cultivo da E.coli á 30ºC no meio de cultura LB adicionado de isopropil β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG 0,5 mM). A presença da TRX1 ligada a Glutationa S-transferase (GST) foi certificada por meio de eletroforese SDS-PAGE. A concentração da proteína foi determinada pelo método de Bradford. A Glicoamilase foi desnaturada a 15 μM com tampão desnaturante (pH 7,0), contendo ureia 8 M; fosfato de potássio 0,1 M; EDTA 2 mM e DTT 20 mM, por 15 minutos a temperatura ambiente. Depois foi diluída 50 vezes e tratada com tampão de renaturação Hepes/KOH 40 mM (pH 7,8); com tampão de renaturação e TRX1 (5 μM) e só com a TRX1 (5 μM). A glicoamilase tratada com tampão de renaturação, tampão de renaturação mais TRX1 e somente com TRX1 foi incubada por 40 minutos a 20ºC. O ensaio prosseguiu por mais 40 minutos, incubando cada condição de tratamento da glicoamilase descrita acima com o substrato, amido 0,5% . A atividade da glicoamilase foi lida em espectrofotômetro no comprimento de onda de 650 nm. O experimento foi realizado em duplicata e o desvio padrão foi calculado.

RESULTADOS:

A indução da expressão da TRX1 pela E. coli foi suficiente para realização dos experimentos propostos. E a proteína recombinante induzida foi observada em eletroforese de gel de poliacrilamida SDS-PAGEE, tendo sido bastante significativa. Os ensaios de atividade de chaperona indicaram que a recTRX1 auxiliou na renaturação da glicoamilase. Em bactérias é descrito a capacidade que as TRXs têm de interagir com as proteínas o que é fundamental para que ela possa participar do processo de renaturação. Neste trabalho, ao comparar a atividade da glicoamilase tratada apenas com o tampão de renaturação com ela tratada com tampão de renaturação acrescido de recTRX1, observou-se uma variação de 23,25 U/ mL para 67,5 U/ mL. Este dado reforça o papel das TRXs na promoção do dobramento de proteínas. Uma unidade de atividade da Glicoamilase foi determinada como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 μmol de açúcar redutor por minuto, nas condições de ensaio.

CONCLUSÃO:

O presente trabalho possibilitou verificar o papel de chaperona da proteína recombinante TRX1, uma vez que os resultados obtidos indicaram um aumento da capacidade renaturante do tampão na renaturação da glicoamilase quando adicionado de recTRX1.

Palavras-chave: Tiorredoxina, Renaturação, Enzima.