63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 4. Genética Molecular

PERFIL QUANTITATIVO DA EXPRESSÃO DE GENES ENVOLVIDOS NA PROTEÇÃO CONTRA MORTE CELULAR DO GUARANAZEIRO E DE ESPÉCIES AFINS

Danival Vieira de Freitas 1 Sérgio Ricardo Nozawa 2 Carlos Gustavo da Silva Nunes 3 Paula Cristina da Silva Ângelo 5 Daniela Pereira Dias 4 Spartaco Astolfi Filho 3

1. Prof. Dr. - Universidade Federal de Goiás / Campus Jataí 2. Prof. Dr. - Universidade Nilton Lins 3. Prof. Dr. - Universidade Federal do Amazonas 4. Profa. Dra. - Universidade Federal de Goiás / Campus Jataí 5. Dra. - Embrapa Amazônia Ocidental

INTRODUÇÃO:

P. cupana var. sorbilis (guaranazeiro) é uma espécie nativa de importância econômica e social na Amazônia devido às múltiplas e comprovadas propriedades medicinais e estimulantes do extrato do seu fruto. Devido a grande importância socioeconômica e a carência de estudos genéticos e moleculares, P. cupana tem atraído considerável interesse científico, por exemplo, a “Rede da Amazônia Legal de Pesquisas Genômicas – REALGENE” formado por um consórcio e apoiado pelo CNPq/MCT, que está estudando o genoma funcional (transcriptoma do fruto) do guaranazeiro. A análise do transcriptoma do fruto permitiu a descoberta de 8.597 seqüências gênicas - ESTs (2.628 contigs e 5.969 singlets). Entre estas seqüências foram identificadas inúmeras referentes a genes de interesse biotecnológico. O objetivo principal do presente trabalho foi determinar o perfil quantitativo da expressão de genes envolvidos na proteção contra morte celular (inibidor de Bax-1 e defesa contra morte celular) por meio de PCR em Tempo Real (qRT-PCR) em diferentes estágios de desenvolvimento do fruto do guaranazeiro e de outras espécies afins do gênero Paullinia (guaranaranas).

METODOLOGIA:

O material vegetal foi coletado no Banco de Germoplasma de Paullinia sp., existente na sede da EMBRAPA/CPAA no município de Manaus. O RNA total foi extraído de diferentes acessos e tecidos, utilizando o reagente Concert Plant RNA da Invitrogen. Os RNA’s foram quantificados no Nanodrop para confirmar a concentração e integridade e, em seguida, tratados com enzima DNAse. Posteriormente, foi realizado PCR convencional e quantificação no Nanodrop para confirmar a ausência de DNA. A síntese de cDNA foi realizada a partir de 1 µg de RNA total utilizando o kit First Strand cDNA Synthesis. Para confecção dos iniciadores foram selecionadas todas as seqüências do inibidor de Bax-1 (BI-1) e defesa contra morte celular (DACD) expressas no fruto do guaranazeiro. Preliminarmente, as seqüências foram caracterizadas in silico com relação a sua função biológica. Para confecção dos primers foi utilizado o software Primer Express (Applied Biosystems). As reações de PCR, para a análise de expressão por RT-PCR em tempo real, foram realizadas com “SYBR Green, utilizando a catalase do guaranazeiro como gene constitutivo, no aparelho ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Os dados gerados pelo qRT-PCR foram processados utilizando o método ΔΔCt.

RESULTADOS:

A partir da biblioteca de cDNA do fruto do guaranazeiro foram selecionadas e caracterizadas in silico, as sequências dos genes de interesse (BI-1 e DACD), responsáveis pela defesa contra morte celular. As sequências de cDNA do guaranazeiro que apresentaram melhor hit com BI-1 e DACD possuem 1.302 e 727 bp respectivamente. A BI-1 apresentou 65% de homologia com Lycopersicum esculentum e DACD 89% com Arabidopsis thaliana. Em um prévio estudo apresentamos, também, o perfil quantitativo da expressão de BI-1 e DACD por meio de PCR em Tempo Real (qRT-PCR) de três estágios de desenvolvimento (fase inicial, intermediária e final de maturação) do fruto do guaranazeiro e das guaranaranas. A expressão de BI-1 foi maior na fase final de maturação dos frutos do guaranazeiro, enquanto que DACD foi maior na fase intermediária, com ausência de expressão na fase inicial. BI-1 e DACD foram super expressos nas guaranaranas quando comparados com a expressão no guaranazeiro, sendo mais evidente na fase intermediária de desenvolvimento dos frutos. O índice de correlação das expressões de BI-1 e DACD nos diferentes estágios do fruto do guaranazeiro e das guaranaras foi de 80%.

CONCLUSÃO:

Neste estudo apresentou-se a validação dos transcritos BI-1 e DACD expressos no fruto do guaranazeiro. Os genes de interesse BI-1 e DACD provavelmente foram expressos devido a biogênese e morfogênese dos frutos, ou a algum estímulo biótico ou abiótico que estimulam as vias associadas, similar a defesa contra apoptose em outros organismos. Estas observações suportam a idéia de que BI-1 e DACD poderiam ter conservado suas funções em organismos diversos ao longo da evolução.

Palavras-chave: Paullinia cupana var sorbilis, qRT PCR, REALGENE.