63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 10. Microbiologia - 2. Microbiologia Aplicada

Análise dos Açúcares Liberados pela Hidrólise Enzimática de Bagaço de Cana-de-Açúcar por Cromatografia de Camada Delgada.

Ilítia Ganaê de Oliveira Costa 1 Fabrícia Paula de Faria 2 Rosália Santos Amorim Jesuíno 3 Guilhermar Ramos de Melo 4 Syd Pereira Faria 5

1. Instituto de Ciâncias Biológicas - UFG 2. Profa. Dra./ Orientadora - Instituto de Ciências Biológicas - UFG 3. Profa. Dra./ Instituto de Ciências Biológicas - UFG 4. Instituto de Ciâncias Biológicas - UFG 5. Instituto de Ciâncias Biológicas - UFG

INTRODUÇÃO:

A xilana é um dos principais constituintes da fração hemicelulósica presente na parede de células vegetais e, após a celulose, é o polissacarídeo mais abundante na natureza. As endo-xilanases formam o principal grupo de enzimas hidrolíticas envolvidas na degradação da xilana, pois clivam a cadeia central da xilana liberando xiloligossacarídeos que serão convertidos em xilose pela beta-xilosidase. A análise dos açúcares liberados pela hidrólise da xilana com endo-xilanases é importante para compreender o modo de ação da enzima. O gene hxyn2 codifica a endo-xilanase HXYN2 do fungo termofílico Humicola grisea var. thermoidea e foi expresso na levedura Pichia pastoris sob o controle do promotor do gene AOX1. A enzima recombinante HXYN2r foi secretada como uma enzima ativa de 23 kDa com pH e temperatura ótimos de 6,5 e 60ºC; termo-estabilidade a 50°C por mais do 3 h e estabilidade de 100% após 4 h de incubação no pH ótimo; Km de 7,9 mg/mL e Vmáx de 235,4 μmol/(mL.min). O objetivo deste trabalho foi analisar os produtos de hidrólise da gerados pela ação da HXYN2r purificada e presente no sobrenadante de cultura da P. pastoris. Analisou-se a ação enzimática sobre xilana extraída de aveia e de bagaço de cana-de-açúcar utilizando o método de Cromatografia de Camada Delgada (CCD).

METODOLOGIA:

Para a produção da HXYN2r, o transformante 12.3 foi inoculado em meio BMGY-U e incubado a 30ºC sob constante agitação até atingir a OD600 de 20. A cultura foi transferida para o meio BMMY-U e incubada nas mesmas condições por 96 h. Após este período a cultura foi submetida a centrifugação e o sobrenadante de cultura analisado quanto ao perfil de proteínas por SDS-PAGE, e a atividade xilanolítica pelo método de açúcares redutores – DNS. Para a padronização das condições de hidrólise variou-se o tempo de incubação (1-24 h), a concentração da enzima (25 e 50 U/mL) e a agitação. A reação de hidrólise foi realizada incubando-se a xilana com tampão fosfato de sódio 50 mM pH 6,5 por 1 h a 50°C, com posterior adição da enzima por diferentes tempos. A reação de hidrólise foi submetida a centrifugação e o sobrenadante analisado quanto aos produtos de hidrólise após precipitação com TCA 10%, Etanol 95% ou sem precipitação. A CCD foi realizada utilizando-se placa de Sílica Gel como fase estacionária e as seguintes misturas como solvente: acetato de etila, ácido acético glacial, ácido fórmico, água (9:3:3:1), acetonitrila e água (85:15). A revelação foi realizada utilizando metanol e ácido sulfúrico (95:5).

RESULTADOS:

A enzima produzida em frasco obteve atividade de 171,58 U/mL. As melhores condições para a hidrólise da xilana WFAX pela enzima HXYN2r foram: 50 U da enzima/g de substrato por 24 h com agitação. Os melhores resultados das análises por CCD foram obtidos utilizando o hidrolisado com precipitação com TCA 10% seguido de Etanol 95%. O melhor solvente analisado foi acetato de etila, após duas corridas e revelação com solução de ácido sulfúrico.

CONCLUSÃO:

Os resultados de CCD obtidos demonstram que após a hidrólise da xilana pode-se observar bandas referentes a xilooligossacarídeos contendo no mínimo duas unidades de xilose, não se observou a liberação de xilose confirmando a ação da enzima HXYN2r como uma endo-xilanase. Os resultados obtidos com enzima HXYN2r presente no sobrenadante de cultura da P. pastoris apresentaram resultados similares como esperado.

Palavras-chave: Endo-xilanase, Pichia pastoris, xilo-oligossacarídeos.