63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 5. Genética Vegetal

AMPLIFICAÇÃO HETERÓLOGA, DESENVOLVIMENTO E OTIMIZAÇÃO DE INICIADORES DE REGIÕES MICROSSATELITES NO GENOMA DE Eugenia klotzschiana Berg

Camila Fernanda Costa 1 Mariana Pires de Campos Telles 2

1. Laboratório de Genética e Biodiversidade (LGBIO), Universidade Federal de Goiás (UFG). 2. Prof. Dr./ Orientadora - Laboratório de Genética e Biodiversidade (LGBIO) , UFG.

INTRODUÇÃO:

Eugenia klotzschiana Berg. destaca-se por ser uma espécie frutífera endêmica do cerrado brasileiro que produz um fruto de sabor agradável e aroma intenso.Possui características ecológicas e de biologia reprodutiva bastante peculiares, intrigantes e pouco conhecidas.As seqüências de DNA cujos nucleotídeos estão arranjados em tandem, contendo combinações de motivos de repetição compostos de um a seis pares de bases, são denominadas regiões microssatélites. A proximidade evolutiva entre duas espécies permite que os pares de iniciadores sejam utilizados com sucesso em espécies pertencentes ao mesmo gênero (amplificação heteróloga). A disponibilidade do genoma completo de uma espécie, através do sequenciamento, permite a determinação e identificação dessas seqüências de SSRs em toda extensão do genoma. A freqüência de ocorrência das regiões microssatélites tem sido estimada experimentalmente para diversos genomas por técnicas de hibridização permitem a posterior construção de bibliotecas genômicas e a busca dessas regiões usando ferramentas de bioinformática. Neste contexto, o objetivo deste trabalho é testar a transferibilidade, desenvolver e otimizar regiões microssatélites do genoma da espécie Eugenia klotzschiana a fim de colaborar da definição de estratégias de manejo e conservação da espécie.

METODOLOGIA:

O DNA foi extraído a partir do tecido vegetal foliar utilizando o protocolo CTAB. A quantificação do DNA foi realizada em gel de agarose 1% com o auxílio de um marcador de peso molecular conhecido.Para a padronização da reação em cadeia da polimerase os testes de amplificação heteróloga foram realizados com três indivíduos em cada par de iniciador. Foram avaliadas diferentes temperaturas de anelamento,a fim de possibilitar a individualização dos alelos no loco e a obtenção dos genótipos. Os produtos da amplificação foram submetidos à eletroforese vertical em gel de poliacrilamida 6%, utilizando TBE 1X, corados com nitrato de prata. Para estimar o tamanho dos alelos foi utilizado o marcador de peso molecular 10 bp Ladder da InvitrogenTM.Para realizar o isolamento das regiões microssatélites, o DNA foi clivado por sonicação para obtenção de fragmentos entre 500pb e 1Kb. Em seguida foram inseridos no vetor pMOSBlue para a clonagem das bibliotecas shotgun. O DNA dos clones foi extraído (miniprep) e seqüenciados (ABI3100). As seqüências geradas foram preparadas no site http://citosina.biomol.unb.br/papirus e as buscas das regiões repetitivas foram feitas no software WebSat para um mínimo de seis repetições nos mononucleotídeos e quatro para os di, tri, tetra, penta e hexanucleotídeos.

RESULTADOS:

Foi possível obter sucesso na amplificação heteróloga no genoma de E. klotzschiana. Dos sete iniciadores testados, três (Embra_210, Embra_122 e Embra_72) apresentaram bom padrão de amplificação (Tabela 1), com capacidade de gerar fragmentos (alelos) de fácil visualização, quando submetidos à temperatura de anelamento adequada, sendo, portanto, considerados transferidos com sucesso. No total foram seqüenciados 768 clones que geraram 54.042 seqüências de bases com valores de Phred ≥ 20. Com isso, foi possível encontrar 460 regiões microssatélites com diferentes tamanhos de motivos repetitivos (Tabela 01). Estavam presentes os dinucleotídeos GA(n), TC(n) e TA(n); os trinucleotídeos TTA(n), TAA(n), AAG(n), GAA(n), AGG(n) e AGA(n); os tetranucleotídeos CCGA(n), CCCT(n) e TTTC(n); e o hexanucleotídeo CCTAAA(n).

CONCLUSÃO:

Embora o fato de existirem regiões repetitivas não garanta o desenho de iniciadores nas regiões flanqueadoras e a utilização dos mesmos como marcadores microssatélites, foi possível detectar boas sequências em três regiões contendo os seguintes motivos e quantidades de repetição: TC(17), GA(8), AGG(7).

Palavras-chave: perinha-do-cerrado, shotgun, SSR.