63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 10. Microbiologia - 2. Microbiologia Aplicada

PREPARO DE DNA PARA IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS FERMENTATIVAS DO TRATO GASTRINTESTINAL DE JUNDIÁ (Rhamdia sp.)

Caroline Giovana Mendes 1 Humberto Maciel França Madeira 1, 2 Marlise Teresinha Mauerwerk 1, 3 Elori Mieko Oikawa 1, 3 Kárita Claudia Freitas Lidani 4

1. Centro de Ciências Agrárias e Ambientais - PUCPR 2. Prof. Dr. Orientador 3. Colaborador 4. Colaborador externo

INTRODUÇÃO:

A piscicultura no Brasil é um fenômeno crescente, que se desenvolve principalmente por conta das condições climáticas favoráveis e à abundância de recursos hídricos. Tem-se observado um renovado interesse da comunidade científica pela compreensão da microflora intestinal de peixes, sobretudo motivado para desenvolvimento de produtos probióticos, visando à saúde dos animais e ganhos nutricionais. Técnicas moleculares que não necessitam do cultivo bacteriano têm sido utilizadas para caracterizar ecossistemas complexos. O gene 16S RNAr, da subunidade menor do RNA ribossomal de microrganismos, é usado em estudos de diversidade por estarem presentes em todas as bactérias, por serem funcionalmente constantes e porque a maior parte de sua sequência é altamente conservada, gerando informação precisa e confiável. O trabalho teve como objetivo aplicar técnicas moleculares de isolamento e amplificação do DNA microbiano do conteúdo do trato digestivo de peixes, para subsequente determinação da diversidade de bactérias anaeróbias.

METODOLOGIA:

Foram utilizados seis (6) jundiás oriundos do Laboratório de Pesquisa e Piscicultura (LAPEP/PUCPR) e os experimentos seguintes foram realizados no Laboratório de Biologia Molecular Aplicada à Agropecuária (PUCPR). O trato gastrintestinal foi seccionado em estômago e intestino. A extração do DNA microbiano foi realizada por lise direta das células bacterianas utilizando rompimento físico com beadbeater aliado à extração química com fenol:clorofórmio. O gene 16S RNAr foi amplificado pelo método da reação em cadeia da polimerase (PCR) touchdown, e a verificação da amplificação feita por eletroforese em gel de agarose 1,5%.

RESULTADOS:

O protocolo de extração foi eficiente para isolamento de DNA do conteúdo do trato intestinal de jundiá. Um protocolo de amplificação por PCR touchdown foi otimizado, permitindo a amplificação do fragmento do gene de interesse. A presença de compostos inibitórios exigiu a diluição das amostras para obtenção de amplificações de maior especificidade.

CONCLUSÃO:

A amplificação do gene 16S RNAr demonstra que o PCR touchdown é adequado para amplificação de amostras de ecossistemas complexos, apesar de exigir que, em função da presença de compostos inibitórios no trato digestivo, possa ser necessária a diluição das amostras antes da amplificação. A subsequente clonagem e o sequenciamento dos produtos de amplificação do gene 16S RNAr permitirá a identificação em nível molecular das espécies presentes.

Palavras-chave: PCR touchdown, 16S RNAr, Jundiá.