64ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 3. Genética Humana e Médica

Padronização da técnica de citogenética convencional por bandeamento G para células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea.

Isadora May Vaz 1 Tamara Borgonovo 1 Paulo Roberto Slud Brofman 1

1. Nucleo de Tecnologia Celular - PUCPR

INTRODUÇÃO:

A análise citogenética é crucial para avaliação do potencial uso terapêutico de células tronco devido à possibilidade de transformação tumorigênica destas células quando cultivadas. Citogenética convencional com bandeamento G é considerada padrão-ouro para avaliação de uma linhagem celular e tem como objetivo tornar visível as bandas de cada cromossomo, permitindo assim identificá-los e avaliar possíveis aberrações.

METODOLOGIA:

Para este estudo foram utilizadas células tronco mesenquimais (CTMs) cultivadas a partir da medula óssea, de oito pacientes. Após o isolamento e cultivo das células o crescimento das CTMs foi interrompido com inibidor mitótico (colchicina ou colcemid). As células foram ressuspendidas em 6ml de KCl aquecido a 37°C por 15 minutos. Depois de outra centrifugação e retirada de sobrenadante, foram adicionados q.s.p. 5ml de fixador 3:1 (metanol/ácido acético), gelado, mantido por 2 a 16 horas em geladeira. Mais duas lavagens foram feitas com fixador 2:1 As lâminas foram preparadas em ambiente úmido (banho-maria a 65ºC) e submetidas às quatro etapas que compõem o bandeamento. A primeira é a imersão em solução de tripsina, a segunda, lavagem em solução fisiológica (NaCl) com soro bovino fetal, seguidas por lavagem em água destilada e por fim imersão em corante. Vários testes foram realizados comparando diferentes concentrações de soluções e tempos, para se alcançar um protocolo ideal.

RESULTADOS:

Em todos os casos foram obtidas metáfases adequadas para análise. O índice mitótico e o padrão de bandeamento foram satisfatórios. Observou-se que para obter cromossomos com boa qualidade as amostras deveriam ser colhidas quando estavam com aproximadamente 80% de confluência, terem seu crescimento interrompido com a adição de colcemid (0,1 µg/mL) por 3 a 6 horas, depois ser mantidas com solução hipotônica tamponada por 20 minutos a 37°C em seguida fixadas com fixador metanol/ác.acético 2:1 e 3:1. Para o bandeamento a solução de tripsina (0,015g/mL de NaCl) deve ser aquecida para então mergulhar as lâminas, que depois devem ser lavadas em solução com soro bovino fetal e posteriormente lavadas em água. Para uma boa coloração com Giemsa, foram necessários pelo menos 7 minutos.

CONCLUSÃO:

Um protocolo para Citogenética Convencional por bandeamento G pôde ser padronizado para CTMs de medula óssea, estabelecendo as condições ideais para obter cromossomos de boa qualidade, permitindo assim uma análise confiável.

Palavras-chave: Células-tronco mesenquimais, Citogenética