64ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 6. Bioquímica

Enriquecimento de Fosfopeptídeos das Linhagens Melan-A, TM1 e TM5 por precipitação por fosfato de cálcio e Cromatografia de Afinidade por Metal (IMAC) e Detecção por MALDI-TOF/TOF-MS

Nívea Maria Rocha Macedo 1 Lara Zimmermann 2 Roger Chammas 2 José César Rosa 3

1. SETOR DE GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR, INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE - UFAL 2. LABORATÓRIO DE ONCOLOGIA EXPERIMENTAL, FACULDADE DE MEDICINA – USP 3. CENTRO DE QUÍMICA DE PROTEÍNAS, DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR E BIOAGENTES PATOGÊNICOS, FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO - USP

INTRODUÇÃO:

A identificação e caracterização em larga-escala de fosfoproteínas em sistemas biológicos complexos é um desafio, já que existe um grande número de sítios de fosforilação nos organismos, baixa estequiometria de fosforilação, baixa abundância de muitas proteínas fosforiladas e natureza dinâmica da fosforilação protéica. A fosfoproteômica fornece pistas de quais proteínas ou vias devem estar alteradas, já que a mudança no estado de fosforilação de proteínas quase sempre reflete em uma mudança na atividade protéica, dando indícios de quais moléculas devem ser potenciais alvos de drogas. Existem evidências da existência de fosfoproteomas tumor-específicos, já tendo sido demonstrado ser possível distinguir, por exemplo, o fosfotirosina-proteoma de tumores de fígado e mama. Isso fornece a prova de que é possível usar o fosfoproteoma para encontrar potenciais biomarcadores. Dessa forma, o presente estudo investigou o fosfoproteoma, por meio do enriquecimento de fosfopeptídeos por precipitação com fosfato de cálcio e IMAC, das linhagens celulares Melan-A, derivada de melanócitos, e de duas linhagens de melanoma derivadas de Melan A, denominadas TM1 e TM5.

METODOLOGIA:

Os extratos protéicos de Melan-A, TM1 e TM5 foram solubilizados no tampão 7,7 M, tiouréia 2,2 M, CHAPS 4,4 %, tris-HCl 10 mM e precipitados com uma solução de clorofórmio:metanol. Em seguida, as amostras contendo 900 µg de proteínas foram re-dissolvidas em 40 µL tampão CHAPS 0,1% e uréia 8 M e diluídas 10 vezes em tampão bicarbonato de amônio 25 mM contendo tripsina (3 µg). Para a precipitação com fosfato de cálcio, foram adicionados 16 µL de uma solução de Na2HPO4 0,5 M, 16 µL de uma solução de NH3.H2O 2M e 16 µL de uma solução de CaCl2 2M às amostras de peptídeos tripsínicos em 400 µL de bicarbonato de amônio 25 mM pH 8,0. As amostras foram centrifugadas e a fração precipitada foi submetida à cromatografia líquida em fase reversa e suas frações de peptídeos foram coletadas diretamente na placa para análise em MALDI-TOF/TOF. Os peptídeos tripsínicos contidos no sobrenadante do processo de enriquecimento por precipitação com fosfato de cálcio, foram dessalificados, dissolvidos em 100 µL de uma solução de ácido acético 5% e aplicados à resina IMAC. Os fosfopeptídeos foram eluídos em 5 adições de 20 µL de uma solução de bicarbonato de amônio 0,1 M e essas frações foram acidificadas com ácido fórmico e submetidas à separação cromatográfica em fase reversa e analisadas por MALDI-TOF/TOF.

RESULTADOS:

Essa abordagem possibilitou a identificação de 223 fosfoproteínas nas três linhagens celulares, das quais 28 foram comuns a todas as três, 28 fosfoproteínas foram identificadas somente em TM1 e TM5, apenas 2 fosfoproteínas foram comuns à Melan-A e TM1 e 6 foram comuns à Melan-A e TM5. Foi observado que 169 fosfopeptídeos identificados contêm fosforilação em Ser ou Thr e, portanto, representam a maioria dos fosfopeptídeos detectados. Este resultado é completamente coerente com outros estudos similares descritos na literatura, uma vez que se estima que mais de 90% das fosforilações em células eucarióticas ocorrem em Ser e Thr. As fosfoproteínas identificadas em Melan-A, TM1 e TM5 foram agrupadas por função molecular e participação em processos biológicos através do programa GeneTools, que resultou em um agrupamento de fosfoproteínas ligantes de metais em TM1 e TM5 em relação a Melan-A e uma relação inversa quanto a fosfoproteínas funcionalmente envolvidas na adesão celular. Estudos têm indicado que células de melanoma são mais suscetíveis à intoxicação por metais do que melanócitos e a diminuição de fosfoproteínas envolvidas em adesão são congruentes com o fenótipo apresentado por TM1 e TM5, que é de perda de adesão e resistência a anoikis.

CONCLUSÃO:

A investigação realizada neste trabalho contribuiu para o estabelecimento de metodologia proteômica para os estudos de modificações pós-traducionais e também contribuiu para um melhor entendimento da biologia das células TM1 e TM5, transformadas em malignantes a partir de Melan-A, no sentido de compreender esse modelo murino de melanoma.

Palavras-chave: Melanoma murino, Proteômica, Fosfoproteoma.