64ª Reunião Anual da SBPC
C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 1. Biologia Molecular
RESPOSTA TRANSCRICIONAL À ITRACONAZOL NO FUNGO PATOGÊNICO HUMANO Paracoccidioides brasiliensis
Nayche Santiago Pacheco de Santana 1
Benedito Rodrigues da Silva Neto 1,2
Patrícia Fernanda Zambuzzi Carvalho 1
Célia Maria de Almeida Soares 1
Maristela Pereira 3
1. Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás - UFG.
2. Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, UFG.
3. Profa. Dra./Orientadora – Instituto de Ciências Biológicas – UFG.
INTRODUÇÃO:
Paracoccidioides brasiliensis é um fungo ascomiceto dimórfico patogênico, endêmico da América Latina causador de doença primária em seres humanos. A infecção em humanos se inicia quando propágulos são inalados pelas vias respiratórias. Uma vez introduzido no hospedeiro, o propágulos micelianos tem que se converter às leveduras, uma condição essencial para o fungo sobreviver e proliferar. O fungo provoca a paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica prevalente na América Latina.
A quimioterapia atual dessa micose é baseada em sulfonamidas, anfotericina B e derivados azólicos, principalmente o Itraconazol. Embora esses medicamentos geralmente sejam eficazes, a longa duração da terapia e da toxicidade faz com que seja necessário explorar novas alternativas para o tratamento de infecções graves. Medicamentos triazólicos (como Itraconazol) inibem a síntese de ergosterol, que é um componente essencial das membranas celulares de fungos, causando alterações na permeabilidade da membrana e a morte da célula. Nosso objetivo foi identificar categorias funcionais dos transcritos para a elucidação do mecanismo de ação do Itraconazol, que pode nos fornecer informações sobre os mecanismos moleculares de crescimento, metabolismo, patogênese e resistência do fungo.
METODOLOGIA:
Foi utilizado o isolado Pb01 (ATCC MYA-826) de P. brasiliensis já caracterizado e padronizado em nosso laboratório. O fungo na fase leveduriforme foi cultivado por 7 dias em meio Fava Netto sólido ( Fava-Netto, 1955) à temperatura de 37°C. Após este período as células leveduriformes foram extraídas dos tubos e transferidas para o meio MVM líquido à 37 °C onde foram inoculadas com a droga.
A Análise representacional Diferencial (RDA) descrita por (Pastorian et al. 2000) foi utilizada para hibridização subtrativa e consequente geração da biblioteca subtrativa a partir dos RNAs extraídos nas condições experimentais com e sem o antifúngico. Após o sequênciamento no MegaBACE 1000 DNA sequencer (GE Healthcare) foram realizadas análises de Bioinformática no programa Blast2GO para o processamento das ESTs. E finalmente foram analisadas em triplicatas as expressões dos genes diferenciais no aparelho StepOnePlusTM realtime PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA).
A partir do potencial da Glutationa-S-tranferase, tal como descrito na literatura como um grupo de enzimas que são importantes na desintoxicação por diferentes xenobióticos, foi avaliada a atividade específica da enzima em extratos protéicos do fungo cultivado com Itraconazol.
RESULTADOS:
Foram seqüenciados 887 com sucesso. Destes, 227 e 223 clones induzidos e reprimidos, respectivamente, obtidos das células leveduriformes após a incubação com itraconazol por 1 hora; 230 e 207 clones induzidos e reprimidos, respectivamente, após 2 horas. Estes foram categorizados funcionalmente.
Avaliamos a expressão desses genes de P. brasiliensis após a exposição à droga através de PCR quantitativa em tempo real. Em seguida observamos a expressão relativa dos genes da via do ergosterol de forma temporal.
Finalmente propusemos o modelo para as mudanças de P. brasiliensis após exposição à itraconazol, mostrando que a droga provocou mudanças nos genes de estresse celular como GST que codifica uma Glutationa S-transferase.
Foram encontrados genes das classes de bombas de efluxo, como proteínas transportadoras de membrana, famílias de facilitadores de transporte (MFS) e proteínas integrais de membrana. Supomos que a desestabilização da membrana e fluxo de ingredientes para o meio extracelular seja devido à inibição do ergosterol.
Foi possível avaliar o aumento da atividade de GST em relação ao extrato não tratado com o fármaco, validando a correlação da atividade da enzima com a defesa fúngica em resposta aos danos atribuídos ao estresse oxidativo e compostos antifúngicos
CONCLUSÃO:
As análises indicaram a classificação de transcritos em diferentes categorias. A maioria dos genes induzidos estava envolvida no metabolismo lipídico, incluindo precursores do ergosterol, sendo que ERG11, ERG6, ERG3 e ERG5 foram induzidos temporalmente. Além disso, foram encontrados genes envolvidos na resposta celular de estresse (como GST), efluxo de drogas, transporte de pequenas moléculas, fatores de elongação e transcrição, parede, membrana celular e proteínas hipotéticas.
Este é o primeiro estudo usando RDA para analisar mudanças na expressão gênica de P. brasiliensis após a exposição dos triazóis. O perfil da expressão gênica de P. brasiliensis é uma ferramenta útil para a compreensão dos mecanismos de ação e possíveis mecanismos de resistência aos agentes antifúngicos com atividade contra fungos dimórficos patogênicos
Palavras-chave: Paracoccidioides brasiliensis, Itraconazol, Resposta Transcricional.