65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 11. Morfologia - 3. Citologia e Biologia Celular

ENVOLVIMENTO DAS CAVÉOLAS NA PERMEABILIDADE DA BARREIRA HEMATOENCEFÁLICA APÓS ENVENENAMENTO POR Phoneutria nigriventer EM RATOS

Edilene Siqueira Soares - Depto Histologia-Embriologia, IB/Unicamp, Campinas/SP. Monique Culturato Padilha Mendonça - Depto Farmacologia, FCM/Unicamp. Leila Miguel Stávale - Depto Histologia-Embriologia, IB/Unicamp, Campinas/SP. Maria Alice da Cruz-Höfling - Profa.Dra./Orientadora-Depto.Histologia-Embriologia/IB/Unicamp.

INTRODUÇÃO:

A aranha armadeira, Phoneutria nigriventer, é a responsável por muitos acidentes envolvendo envenenamentos acidentais no Brasil. O veneno (PNV) produzido pela aranha é constituído por peptídeos simples com ação neurotóxica. A ação do PNV sobre a barreira hematoencefálica (BHE) está sendo documentada. Em condições normais a BHE mantém a homeostasia do ambiente neural através do controle do tráfego de moléculas na interface sangue-cérebro. A quebra da BHE está relacionada a muitas patologias que acometem o sistema nervoso central (SNC). O PNV interfere na dinâmica da BHE através da permeabilização das junções celulares (via paracelular) e do aumento das vesículas em tráfego pelo endotélio vascular (via transcelular). As cavéolas são invaginações da membrana celular envolvidas com a sinalização celular e a internalização de moléculas via endocitose, seu aumento no endotélio vascular está relacionado à formação de edema cerebral e aumento do fluxo de substancias pela célula. O estudo da expressão diferencial da caveolina-1 (cav-1), principal integrante das cavéolas, no hipocampo pode fornecer novos elementos para a compreensão da estrutura da BHE e dos mecanismos utilizados pelo PNV para sua manipulação.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Avaliar a expressão da cav-1 e seu RNA mensageiro no hipocampo por western blotting (WB) e PCR em tempo real, além de analisar sua distribuição regional nas áreas CA1, CA2 e CA3 do hipocampo através de imuno-histoquímica (IHQ) após 2h, 5h e 24 h de administração do PNV. Ainda, investigar diferenças na resposta de ratos neonatos (P14) e adultos (8-10S) após envenenamento.

MÉTODOS:

Ratos Wistar machos de 8 a 10 semanas (grupo adulto ou 8-10S, 250±300g) e 14 dias (grupo neonato ou P14, ±30g) receberam dose subletal via intra-peritoneal de PNV (grupo PNV) ou solução salina 0,9% (grupo sham) ambas na dose 1,70mg/Kg. Após 2h, 5h e 24h (n=5/grupo) os animais foram sacrificados e o hipocampo foi dissecado e processado para WB, PCR ou IHQ. Para WB e IHQ foi utilizado anticorpo para cav-1 enquanto para PCR em tempo real foi utilizado o primer para o gene da cav-1. A localização da cav-1 nas diferentes regiões hipocampais (CA1/CA2/CA3) foi realizada com auxilio de um Atlas de Anatomia. O teste t-Student foi aplicado e as diferenças consideradas significativas tendo p<0,05*.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

A IHQ indicou uma imunomarcação exclusivamente endotelial e revelou maior marcação nos vasos da região CA3 para os animais de 8-10S, enquanto P14 apresentou intensa imunomarcação em CA1/CA2/CA3. A expressão da proteína cav-1 no hipocampo como um todo (WB) mostrou que às 2h e 5h não houve alterações estatísticas significativas na expressão de cav-1 para nenhuma das idades (2h: P14=84±9.87vs84.43±3.28; e 8-10S=93.13±6.87vs75.43±7.99; 5h: P14=83.93±5.14vs92±6.24; e 8-10S= 88.37±6.29vs97.47±2.53). Após 24h ocorre um aumento na expressão de cav-1 em P14 (86±1.6vs98.1±1.9), em 8-10S sua expressão se manteve estável às 24h (94.7±4.67vs92.5±0.32). Para a expressão do RNAm, não ocorrem alterações estatísticas significativas para P14 em nenhum dos horários analisados, enquanto os animais de 8-10S apresentam um aumento no RNAm para cav-1 5h após PNV sendo que às 2h e 24h não há alterações estatísticas significativas. Em conjunto esses dados apontam os neonatos como mais susceptíveis às alterações fisiológicas no ambiente neural, neste contexto, após envenenamento acidental em humanos há uma maior gravidade nos casos envolvendo crianças do que em adultos o que pode ser reflexo de uma maior susceptibilidade aos peptídeos do PNV.

CONCLUSÕES:

A cav-1 atua diretamente na endocitose e seu aumento às 24h em resposta ao veneno corrobora a interferência tardia do PNV sobre a via transcelular. Nos ratos P14 o aumento da expressão de cav-1 após administração de PNV sugere um aumento na internalização de vesículas pelas células endoteliais e indica uma maior suscetibilidade às alterações promovidas pelo PNV no ambiente neural. Apesar dos animais de 8-10S apresentarem aumento no RNA mensageiro para cav-1, alterações na expressão da proteína total não são detectadas por WB o que pode ser um indicio de um controle mais rigoroso dos mecanismos que mobilizam o aumento das cavéolas no endotélio vascular ao nível da BHE em adultos. Nossos estudos apontam para uma regulação diferencial das cavéolas nas idades estudadas, sendo os animais adultos menos susceptíveis ao aumento da endocitose promovido pelo PNV. A alteração diferencial da região CA3 em relação a CA1/CA2 revela ainda uma resposta regional à interferência do PNV. Assim, estudos estão em curso para caracterizar possíveis alvos do PNV no endotélio cerebral.

Palavras-chave: hipocampo, caveolina-1, veneno.