65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 10. Microbiologia - 2. Microbiologia Aplicada

Efeito antimicrobiano de proteína de 55 kDa purificada de sobrenadantes de cultura de Lactobacillus lactis

Rubens Ferracini Junior - Departamento de Farmácia -Centro Universitário Barão de Mauá Fernanda Ancona Tardelli - Departamento de Farmácia -Centro Universitário Barão de Mauá Virna Aina Mankievich - Departamento de Farmácia -Centro Universitário Barão de Mauá Aristeu Gomes da Costa - Departamento de Farmácia -Centro Universitário Barão de Mauá

INTRODUÇÃO:

O gênero Lactobacillus é considerado um protótipo das atividades dos micro-organismos pertencentes a microbiota humana normal, particularmente relativas ao microbioma intestinal. Este fato deve-se a inúmeras características das espécies desse gênero, consideradas benéficas ao hospedeiro: auxiliam a manter o equilíbrio interespécies no microbioma, melhoram a digestibilidade de vários nutrientes, estimulam o peristaltismo intestinal. Muitos autores também relatam a capacidade destas espécies em estimular, direta ou indiretamente, diferentes funções imunológicas. Essas características vêm sendo extensamente aproveitadas pela indústria alimentícia, particularmente a indústria do leite, em campanhas publicitárias alardeando as benesses de seus produtos pro ou prébióticos. Muitas destas atividades são desencadeadas por ações mecânicas da bactéria, pela competição direta por nicho ou nutrientes, ou então por produtos secretados como bacteriocinas e ácidos graxos. Sob determinadas condições, sobrenadantes de cultura de Lactobacillus apresentam elevado teor proteíco, e já foram utilizados como extrato bruto em ensaios de atividade antimicrobiana, com resultados promissores.

OBJETIVO DO TRABALHO:

- Purificar e fracionar extratos proteicos brutos de sobrenadantes de cultura de Lactobacillus lactis. - Caracterizar as frações proteicas obtidas e submete-las a ensaios de atividade antimicrobiana.

MÉTODOS:

Cepas de Lactobacillus lactis, mantidas no Laboratório II de Microbiologia do Curso de Farmácia, identificadas segundo procedimentos morfometabólicos clássicos, foram reativadas em Ágar BHI, com 3 incubações sucessivas de 24h/37ºC. Em seguida, foi preparada suspensão bacteriana em solução salina fisiológica tamponada (PBS), na densidade de 1x10x<5>/sup> células/mL. Esta suspensão foi utilizada como inóculo para Caldo Nutriente-Tamponado, incubado por 72h/37ºC. Após esse período, o caldo foi filtrado em membranas filtrantes de o,45 µm e 0,22 µm de diâmetro de poro. O sobrenadante obtido, foi então dializado 5 vezes contra água estéril, e o dializado liofilizado. O dializado liofilizado foi ressuspenso em (PBS) e utilizado para fracionamento e purificação em cromatografia líquida. Os fragmentos obtidos foram então caracterizados em espectrômetro de massa, determinando-se algumas características químicas e principalmente seu peso molecular. Separados e identificados, as frações proteicas foram ressuspensas em PBS (concentrações de 100, 50, 25, 12,5 µg/mL), para uso em ensaios de atividade antimicrobiana, pela técnica da placa escavada, contra E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, B. cereus, A. fumigatus, C. neoformans e C. albicans.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

A partir dos sobrenadantes de cultura de Lactobacillus lactis, foram obtidas 5 frações proteicas bem definidas, com pesos moleculares de 25, 35, 43, 55 e 98 kDa. Até esta fase, os procedimentos foram repetidos exaustivamente, principalmente por conta do baixo rendimento geral. A partir de então, com o início dos ensaios de atividade antimicrobiana, verificou-se que as frações proteicas de 35, 43 e 98 kDa, foram completamente inócuas para os microrganismos de desafio. A fração proteica de 25 kDa, apresentou discreta ação inibitória sobre bactérias Gram (+), nenhuma atividade sobre bactérias Gram (-), e curiosamente foi capaz de estimular crescimento das cepas fúngicas utilizadas. Já a fração proteica de 55 kDa, apresentou atividade antifugica absoluta com todas as concentrações utilizadas. Bactérias Gram (-) e Staphylococcus aureus foram também completamente inibidas a partir da concentração 50 µg/mL, enquanto Bacillus cereus, apresentou resultados variáveis quanto a sensibilidade à fração proteica de 55kDa. Todos os ensaios tiveram como controles, suspensões microbianas pares não tratadas e suspensões microbianas pares tratadas com cloranfenicol ou penicilina/estreptomicina, no caso de cepas bacterianas, e com fluconazol ou itraconazol, no caso de cepas fungicas.

CONCLUSÕES:

As ações benéficas de Lactobacillus lactis, assim como de outras espécies do gênero Lactobacillus, são múltiplas e cada uma delas multifacetada. Desde que os primeiros estudiosos de bactérias lácteas, começaram a indicar o provável envolvimento desse grupo bacteriano com estimulação do sistema imune, a idéia de que seriam meros competidores, que impediriam a fixação de patógenos exógenos aos tecidos do hospedeiro, foi sendo ampliada. Na atualidade, Lactobacillus, Lactococcus, entre outros gêneros presentes no microbioma intestinal humano, estão sendo entendidos como “usinas” de metabólitos biologicamente ativos, dentre eles uma coleção crescente de moléculas com atividade antimicrobiana. Neste contexto, a fração proteica de 55 kDa mostrou-se bastante eficiente na atividade antibacteriana e antifúngica “in vitro”. A metodologia utilizada, placa escavada, embora simples, é bastante segura e facilmente empregável em testes de prospecção como o realizado neste estudo. Esses resultados sugerem que metabólitos de Lactobacillus lactis como a fração proteica 55 kDa, podem ser considerados em estudos para ampliar o arsenal de antibióticos, cada vez menor pela emergência de cepas resistentes e mau uso dos antimicrobianos.

Palavras-chave: Lactobacillus lactis, microbioma humano normal, probióticos.