65ª Reunião Anual da SBPC

A. Ciências Exatas e da Terra - 4. Química - 7. Química Orgânica

Identificação de Peptídeos com Ligação Cruzada por Espectrometria de Massas

Lívia Helena Moreira Passos - Faculdade de Engenharia Química - UNICAMP Fábio Cesar Gozzo - Prof. Dr./Orientador - Instituto de Química - UNICAMP

INTRODUÇÃO:

O estudo das interações entre proteínas é importante para o conhecimento das funções dessas proteínas. Uma maneira de se estudar essas interações é através de ligações cruzadas (XL) acoplada a espectrometria de massas(MS). A ligação cruzada consiste em reagir as proteinas que fazem parte de um complexo proteína-proteína com um reagente de ligação cruzada (ALC) que tem um tamanho definido, fazendo com que os resíduos de aminoácidos envolvidos na interação possam ser ligados por esse ALC. A amostra depois de reagida é digerida com uma protease e analisada por MS, que consegue identificar peptídeos contendo a XL através da análise dos fragmentos desses peptídeos. Uma das dificuldades deste método é identificar esses peptídeos que contém a ligação cruzada. Para tal estudo ser facilitado, é necessário o conhecimento de íons marcadores de XL, e é nisto que consiste este projeto. As proteínas utilizadas foram a Mioglobina, Citocromo C e Anidrase e para continuar com a pesquisa dos possíveis íons marcadores, foram usados dados de dois outros membros do laboratório, com espectros que continham amostras com XL detectado manualmente por fragmentação de íons.

OBJETIVO DO TRABALHO:

O principal objetivo é identificar íons precursores de XL entre peptídeos gerados através da digestão de proteínas modificadas com um ALC, aperfeiçoando os parâmetros de MS para a busca dos ions precursores já descobertos, que são os de m/z 222, 239 e 305. Esta é uma pesquisa que auxilia a procura de agentes de XL em proteínas.

MÉTODOS:

Um dos métodos utilizados foi a cromatografia líquida, que consiste em separar as substâncias de um composto através da diferença de interação entre as substâncias injetadas e a coluna do cromatógrafo. Outro método utilizado foi MS, que consiste em medir a razão massa/carga de íons. No caso do experimento foi usado um aparelho do triplo quadrupolo na função de PIS (Precursor ion scan), nesta função o primeiro quadrupolo age varrendo os íons que vem do cromatógrafo; o segundo quadrupolo fragmenta os íons em íons menores, o segundo quadrupolo também é chamado de câmara de colisão, CID (collision induced dissociation); e por fim o terceiro quadrupolo é definido para analisar somente íons de massa/carga pré-definido, neste casso os íons precursores. Para uma XL ser encontrada usando a técnica de espectrometria de massas (MS) é necessária a digestão da proteína com uma enzima após a reação de XL com um agente de ligação cruzada (ACL) para que os peptídeos com e sem modificações (XL) sejam analisados no instrumento de MS.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Foram encontrados sete possíveis íons marcadores de XL, que foram estudados para a avaliação de sua veracidade na função de marcador de XL. Esses íons também foram identificados em dados que já haviam sido detectados XL por outros métodos, no caso dos dados fornecidos por membros do grupo Dalton Laboratório – IQ Unicamp. No experimento com a Mioglobina foram encontrados os íons 240, 296 e 367 como possíveis marcadores. Com o Citocromo C foram encontrados os íons 240, 267 e 320. E nas amostras fornecidas pelo grupo foram encontrados os íons 240, 267, 312 e 314. Esses íons foram estudados para avaliar a sua possível função de íons marcadores, ou seja, estes íons serem parte de uma fragmentação convencional ou realmente a sua presença somente em amostras com XL e sua função de íon marcador de XL. Os dados totais das análises de MS foram utilizados em um software de identificação de proteínas (Mascot, Matrix Science Ltd.) e os valores dos íons de fragmentos convencionais foram procurados nos espectros. A partir dessa comparação foi possível concluir que os potenciais íons marcadores encontrados no estudo atual não correspondem a íons de fragmentos convencionais e podem assim ser considerados possíveis íons marcadores de ligação cruzada.

CONCLUSÕES:

A partir da conclusão que os íons estudados não seriam fragmentos convencionais e da comparação de espectros com e sem XL, os íons estudados podem ser identificados como íons marcadores, presentes somente no espectro com XL. Tais constatações também puderam ser observadas nos espectros dos materiais em que já haviam sidos confirmados XL. Foram utilizadas três proteínas na pesquisa, mas somente duas delas renderam resultados consideráveis. Com a anidrase carbônica não foi possível obter espectros razoáveis para o experimento. Essa falha pode ter sido obtida por problemas de processamento de amostra ou pelo fato das reações com o ALC não terem sido eficientes, pois não há outro tipo de alteração que pudesse ser feita para otimizar a reação da anidrase com o ALC. Esse projeto complementa um artigo a fim de auxiliar o trabalho do grupo do laboratório Dalton na procura de agentes de XL em proteínas, pois com o conhecimento de íons marcadores, é mais fácil identificar um espectro a partir dos íons e não pelo método tradicional de fragmentação dos íons com as massas esperadas e buscar todos os íons possíveis. Assim, os íons m/z 240, 267, 296, 312, 314, 320 e 367 foram identificados como marcadores das espécies de XL, dando uma maior confiabilidade na atribuição dos espectros de XL.

Palavras-chave: Espectrometria de massas, Proteínas, Peptídeos.