65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 4. Genética Molecular

ANÁLISE MUTACIONAL DO PROMOTOR DO GENE DA MIOSTATINA

Carolina Stefano Mantovani - Depto. de Histologia e Embriologia - Unicamp Carla Vermeulen Carvalho Grade - Depto. de Histologia e Embriologia - Unicamp Lúcia Elvira Alvares - Profa. Dra./Orientadora - Depto. de Histologia e Embriologia - Unicamp

INTRODUÇÃO:

Dentre as moléculas-chave envolvidas na regulação da miogênese está a Miostatina, um regulador negativo da deposição de musculatura esquelética. O nocaute de seu gene causa hiperplasia e hipertrofia das fibras musculares, resultando em músculos individuais até duas vezes maiores do que em animais selvagens. A estrutura e a função desta proteína são conservadas em diversas espécies, incluindo humanos, mas pouco se sabe sobre sua regulação gênica. A fim de melhor compreender os mecanismos que regem sua expressão, seu promotor basal foi previamente identificado pelo nosso grupo de pesquisa a partir de uma abordagem filogenética que revelou uma conservação evolutiva surpreendente dos sítios de ligação de fatores transcricionais, que vai do homem aos peixes teleósteos (Miostatina b). Em todos os organismos analisados, verificou-se que o promotor gênico da Miostatina contém, além do TATA box, um sítio para a ligação da proteína homeótica Meis1, um sítio para o receptor de hormônio nuclear FXR e sítios para os fatores CREB e NFY, envolvidos em vias de sinalização mediadas por cAMP. Análises detalhadas do processo de regulação gênica da Miostatina podem gerar informações importantes para o desenvolvimento de tratamentos de doenças relacionadas à musculatura esquelética.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Este trabalho teve como objetivo desvendar o papel dos fatores de transcrição Meis1, FXR, CREB e NFY na modulação da atividade transcricional do promotor gênico da Miostatina, além de verificar a existência de possíveis interações entre esses fatores.

MÉTODOS:

O promotor do gene da Miostatina foi previamente clonado no vetor pGL3-Basic, upstream ao gene repórter da luciferase, e a partir desta construção de expressão inicial (pPMM) foram realizadas reações de mutagênese sítio-dirigida in vitro com o objetivo de criar uma variedade de construções contendo um ou mais sítios de ligação dos fatores transcricionais inativados (pPMMΔ1 a pPMMΔ11). O sucesso de cada mutagênese foi confirmado por sequenciamento, e a atividade de cada construção gerada foi então testada durante a proliferação e a diferenciação de mioblastos C2C12 in vitro.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Em cultura de células C2C12 em proliferação, a inativação do sítio de ligação do fator de transcrição Meis1 gerou um aumento na atividade do promotor da Miostatina em comparação ao promotor intacto, indicando que esta molécula atua como inibidora da atividade do promotor. CREB também demonstrou ter um papel inibitório, enquanto NFY demonstrou atuar como ativador do promotor. Já em células C2C12 em diferenciação, NFY permaneceu como ativador, mas CREB e Meis perderam seu papel inibitório. FXR, por sua vez, não demonstrou efeito significativo sobre a atividade do promotor em nenhum contexto analisado, provavelmente por causa de seu baixo nível de expressão no contexto miogênico. Mutações múltiplas no promotor geraram resultados mais complexos, indicando que também devem ocorrer interações sinergísticas e antagonísticas entre os fatores. Como já foi demonstrado em outros trabalhos, CREB, NFY e Meis1 podem ser influenciados pela sinalização mediada por cAMP, de modo que o estado de fosforilação desses fatores provavelmente interfere na sua atividade, assim como nas interações que eles estabelecem com outras moléculas.

CONCLUSÕES:

O fator de transcrição NFY atua como ativador do promotor da Miostatina durante a proliferação e diferenciação de mioblastos C2C12, enquanto CREB e Meis agem inicialmente como repressores durante a proliferação, mas deixam de exercer esse efeito durante a diferenciação. Por outro lado, FXR demonstrou não ter qualquer efeito sobre a atividade do promotor nesses contextos. As evidências também sugerem que a atuação dessas moléculas pode ser muito mais complexa, uma vez que a maioria dos fatores de transcrição estudados não só têm sua atividade alterada dependendo do contexto, mas também têm influência uns nos outros e em outras moléculas, interagindo ativamente para garantir a estrita regulação do promotor da Miostatina e gerar níveis apropriados de expressão em diferentes contextos celulares, o que demonstra grande dinamicidade dessa região regulatória. A intricada rede de interações verificada neste trabalho abre portas para análises mais detalhadas do processo de regulação gênica da Miostatina, que podem permitir a descoberta de aplicações práticas para o tratamento de doenças relacionadas à musculatura esquelética nas quais os níveis de Miostatina circulante no sangue se encontram elevados, como distrofias musculares e caquexia, que acompanha alguns tipos de câncer e AIDS.

Palavras-chave: Regulação Gênica da Miostatina, Fatores de transcrição, Mutagênese sítio-dirigida.