65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 1. Biologia Molecular

CARACTERIZAÇÃO DA CDC-25B: FOSFATASE COM POTENCIAL APLICAÇÃO EM TERAPIAS ANTICÂNCER

Thayane Previdelli - Instituto de Química - UNICAMP Natália Lais Bazzo - Instituto de Química - UNICAMP Mariana Pereira Dias - Instituto de Química - UNICAMP Valéria Scorsatto - Instituto de Química - UNICAMP Daniela Trivella - Co-Orientadora - Instituto de Química - UNICAMP Ricardo Aparício - Profº. Orientador - Instituto de Química - UNICAMP

INTRODUÇÃO:

De acordo com estudos recentes, as fosfatases são super-expressas em diversos tipos de cânceres humanos, e há correlação entre os níveis da fosfatase com a agressividade do tumor e o mau prognóstico. A CDC-25b humana é um membro da família das fosfatases. Esta proteína está envolvida em vias de sinalização que controlam a taxa de divisão celular e encontra-se super-expressa em diversos tipos de tumores.Contudo, o projeto otimizou os protocolos de expressão e purificação da fosfatase CDC-25b e, além disto, obteve-se boas condições de cristalização resultando em cristais de boa qualidade. Assim, futuramente, estes resultados serão empregados para facilitar a co-cristalização com os potenciais inibidores da fosfatase em estudo. Dado o exposto,a fosfatase CDC-25B é um interessante alvo biológico para o desenvolvimento de novas terapias anticâncer.

OBJETIVO DO TRABALHO:

O projeto objetivou-se: · expressar e purificar a CDC-25B humana em sistema recombinante (E. coli); · testar condições de cristalização da CDC-25B purificada; · coletar e processar dados de difração de raios-X de cristais de CDC-25B · determinar as estruturas cristalográficas da CDC-25B

MÉTODOS:

Inicialmente, as células de E.coli BL21D3 contendo o vetor de expressão foram induzidas a expressão da proteína de interesse com IPTG. Para obtenção da proteína pura, foi empregada a técnica de cromatografia de afinidade em coluna de níquel-agarose e, posteriormente clivou a cauda de histidina. Utilizou-se uma coluna de cromatografia de exclusão por peso molecular para retirar interferentes minoritários. Após este processo verificou-se através ensaios enzimáticos, utilizando como substrato pNPP, a sua forma ativa. Nos procedimentos de cristalização da proteína, diversas condições foram testadas e dentre elas obteve-se melhores resultados utilizando-se o método de sitting-drop, contendo sulfato de amônio (1.6M-2.1M), cloreto de sódio 500mM, em tampão Tris 100mM em pH 7,0-8,5 e β-mercaptoetanol (0,25%). Os experimentos de cinética enzimática com a proteína confirmaram o potencial inibidor de alguns compostos da família das caulibugulonas e de outras moléculas sintetizadas pelos professores do grupo do Temático “Biologia Química: novos alvos moleculares naturais e sintéticos contra o câncer. Estudos estruturais, avaliação biológica e modo de ação” (Fapesp 2009/51602-5). Os cristaisde CDC-25B foram também submetidos a soaking, visando a obtenção dos complexos proteína-inibidor.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Os resultados observados com a eletroforese indicaram ser a melhor estratégia para as futuras purificações, utilizar as seguintes eluições segundo as concentrações de Imidazol: equilíbriar a resina com 20mM, 30mM seguida de quatro eluições com 100mM. Os compostos classificados como potenciais inibidores foram aqueles que apresentaram ação inibitória em 50% da atividade inicial, a 100μmol/L. Diante disto, destacou-se como potenciais inibidores os compostos J349, J355, PM02. No entanto, somente nos compostos RPMbz169, RPMbz170, RPMbz173 e PM02 observou-se que mesmo com a adição da enzima antioxidante catalase, a atividade inibitória não sofreu interferência, indicando que estes não agem por mecanismo oxidativo, o que é comum em inibidores de fosfatases. Na condição de cristalização obtida pode-se atingir boa resolução dos dados de CDC-25B. No entanto, o íon sulfato foi sempre encontrado ocupando o sitio catalítico, o que limitou a obtenção dos complexos cristalográficos.

CONCLUSÕES:

Durante o desenvolvimento deste projeto estabeleceu-se os protocolos de expressão e purificação da CDC-25B e triagem de compostos orgânicos frente a inibição desta enzima, sendo possível identificar alguns inibidores da CDC-25B. Além disto, foi possível obter cristais e determinar a estrutura da enzima.

Palavras-chave: Câncer, Inibidores de Fosfatase, CDC-25b.