65ª Reunião Anual da SBPC

D. Ciências da Saúde - 2. Medicina - 1. Anatomia Patológica e Patologia Clínica

PRODUÇÃO E VALIDAÇÃO DE VETORES RECOMBINANTES PARA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA K1 DE DIFERENTES GENÓTIPOS DO HERPESVÍRUS ASSOCIADO AO SARCOMA DE KAPOSI (KSHV).

Renata Nacasaki Silvestre - Ciências Biomédicas, Instituto de Biociências – UNESP Botucatu, SP Annie Cristhine Moraes Sousa - Depto. de Patologia, Faculdade de Medicina – UNESP Botucatu, SP Deilson Elgui de Oliveira - Prof. Dr./Orientador – Depto. de Patologia, Faculdade de Medicina – UNESP

INTRODUÇÃO:

O herpesvírus associado ao Sarcoma de Kaposi (KSHV) é um gamaherpesvírus com papel na patogenia do Sarcoma de Kaposi (SK). Seu ciclo biológico é dividido em duas fases: latência e ciclo lítico. Dentre os produtos virais expressos predominantemente na fase lítica destaca-se a proteína K1, que aumenta a sobrevida e taxas de proliferação das células infectadas pelo KSHV em virtude de interferência em vias de transdução de sinais intracelulares. Estruturalmente a proteína K1 é dividida em três regiões principais: transmembrana, extracelular e intracelular. Nesta última está localizado um imunoreceptor semelhante a um domínio de ativação tirosino-quinase (ITAM), um dos meios pelos quais K1 interfere em vias de sinalização intracelular. Além de suas propriedades biológicas, K1 apresenta elevada variabilidade em relação aos outros segmentos do genoma viral, possibilitando classificar o KSHV em distintos genótipos, sendo mais comuns os genótipos A, B e C. Até o momento não se sabe se diferentes genótipos virais apresentam características biológicas peculiares, que possam modificar o potencial carcinogênico desse vírus.

OBJETIVO DO TRABALHO:

O presente estudo visou contribuir para a avaliação da hipótese de que diferentes formas da proteína K1 viral causam efeitos biológicos distintos na célula em que é expressa. Para tanto, vetores recombinantes contendo a ORF-K1 de genótipos A, B e C do KSHV foram produzidos e validados.

MÉTODOS:

A ORF-K1 de diferentes genótipos do KSHV foi obtida por meio de amplificação por PCR do DNA de linhagens celulares de linfoma de efusão primária constitutivamente infectadas pelo KSHV. Os amplicons da ORF-K1 viral e o vetor comercial p3xFLAG-CMV-10 foram digeridos pelas enzimas HindIII e BamHI. Inserto e vetor foram ligados e os construtos resultantes foram clonados em bactéria E. coli cepa DH5 α. A avaliação da ligação foi realizada por meio de PCR diretamente a partir de bactérias íntegras submetidas à transformação (PCR colony). Três clones de cada um dos vetores recombinantes foram selecionados arbitrariamente, purificados e submetidos a sequenciamento automatizado de DNA. Com base nos resultados do sequenciamento, um clone de cada vetor foi transfectado em células HEK293. Após extração de proteína das células transfectadas, a expressão de K1 foi avaliada por Western blot (WB).

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

A colony PCR dos vetores recombinantes apresentou amplicons de 1167 pb, conforme esperado. O sequenciamento de DNA demonstrou que ORF-K1 nesses vetores corresponde a sequências-protótipo de K1 das linhagens BC-1, 431KAP e BC-3; de genótipos A, B e C do KSHV, respectivamente. A presença de K1 no lisado de células HEK293 transfectadas foi demonstrada em WB com anticorpo contra o epítopo FLAG fusionado à proteína viral. Foi efetuada análise de sequência de aminoácidos de K1 dos vetores recombinantes, de modo a se demonstrar que a sequência de ITAM de K1 dos clones recombinantes e de sequências-protótipo da proteína era idêntica em clones e protótipos de genótipos A e C, mas distinta em quatro aminoácidos no genótipo B. Assim sendo, por apresentar diferença na sequência de ITAM em relação aos genótipos A e C, é plausível supor que K1 de genótipo B do KSHV apresente efeitos biológicos peculiares na célula em que é expressa.

CONCLUSÕES:

Foram produzidos clones de vetores recombinantes de ORF-K1 de genótipos A, B e C do KSHV. Esses clones recombinantes foram validados estruturalmente (fidedignidade de suas sequências nucleotídicas no que se refere á ORF-K1 viral) e a expressão proteica de K1 foi detectada em células transfectadas in vitro. Além disso, sequências de aminoácidos dos clones de K1 foram avaliadas e validadas comparando-se com sequências-protótipo da proteína nos diferentes genótipos. Conclui-se que os vetores recombinantes produzidos poderão ser empregados para o estabelecimento de modelo experimental para análises subsequentes das propriedades biológicas da proteína K1 do KSHV.

Palavras-chave: Biologia molecular, Carcinogênese viral, Clonagem.