65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 13. Parasitologia - 5. Protozoologia de Parasitos

PADRONIZAÇÃO DA TÉCNICA DE PCR EM TECIDOS PARAFINADOS DE CAMUNDONGOS INFECTADOS COM DIFERENTES CEPAS DO Trypanosoma cruzi E TRATADOS OU NÃO COM BENZNIDAZOL

Nayara Resende Gomes - Instituto Federal Minas Gerais - Campus Ouro Preto Leoneide Bouilet - Dra./Colaboradora - PNPD - CIPHARMA - UFOP Daiane Teixeira de Oliveira - Aluna de IC - Farmácia - UFOP Cláudia Martins Carneiro - Profa. Dra./Co-orientadora - Depto Analíses Clínicas - UFOP Vanja Maria Veloso - Profa. Dra./Orientadora - Depto Farmácia - UFOP

INTRODUÇÃO:

A avaliação da presença de DNA do Trypanosoma cruzi em amostras de tecidos de animais tratados ou não com Benzonidazol pode confirmar resultados obtidos em amostras de sangue, corroborando com avaliação da cura parasitológica. A possibilidade da releitura de material processado e incluído em parafina surge por meio do uso de tecnologias inovadoras, como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), que na ocasião do processamento não estava disponível ou aprimorada para o diagnóstico do parasito.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Padronizar a técnica de PCR em tecidos parafinados de camundongos infectados pelo Trypanosoma cruzi e tratados ou não com Benznidazol, para releitura do material histopatológico arquivado no laboratório de Imunopatologia/ICEB/UFOP.

MÉTODOS:

Inicialmente foi realizada a remoção da parafina externa ao tecido com o auxílio de uma navalha. Utilizou-se micrótomo limpo, com navalhas descartáveis. Após a realização dos cortes, as fatias foram acondicionadas em tubos de 1,5ml e mantidas a temperatura ambiente até o momento da extração. Antes da extração do DNA, na padronização com o kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega), os fragmentos de tecidos contendo parafina residual passaram por um processo de desparafinização, processo este que não foi necessário na padronização com o kit Magnesil (Promega).

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

O presente trabalho, propôs a utilização de tecidos parafinados, que se encontravam armazenados há mais de 10 anos nos arquivos do Laboratório de Imunopatologia. A técnica foi padronizada com sucesso após várias tentativas. Nas extrações de DNA utilizando o kit Wizard Genomic DNA purification – PROMEGA obtive-se excelentes resultados para: (1) amostra extraída com o protocolo adaptado usando cerca de 30 mg de tecido macerado; (2) para as amostras diluídas e extraídas utilizando o protocolo adaptado usando cerca de 30 mg de tecido macerado; (3) para as amostras que foram extraídas com o protocolo do fabricante usando cerca de 30 mg de tecido macerado. Os produtos das PCRs realizadas em material extraído com o KIT Magnesil, foram constituídos de bandas mais fracas em relação às do Kit Wizard Genomic DNA purification. A avaliação da presença de DNA do parasito em amostras de tecidos de animais tratados ou não podem confirmar resultados obtidos em amostras de sangue, corroborando assim com a avaliação da cura parasitológica. Segundo Ludyga et al., 2012 as condições de fixação e de armazenamento pode tornar o material fixado em formol e emblocado em parafina inviável para análise posterior e que para o desenvolvimento de testes de monitoramento da resposta terapêutica, torna crucial a exploração de bancos de tecidos parafinado disponíveis e com técnicas padronizadas.

CONCLUSÕES:

Em todos os métodos utilizados (Extração de DNA com kit Wizard Genomic DNA purification e kit Magnesil) foi possível obter um bom resultado de produto de PCR para a avaliação da presença do parasitismo tecidual. Sendo que os melhores resultados foram obtidos com a extração que utilizou o protocolo adaptado usando cerca de 30 mg de tecido macerado . A utilização desta metodologia é possível e viável de ser utilizada em amostras de tecidos parafinado e arquivados por um longo período de tempo.

Palavras-chave: PCR, Tecido Parafinado, Trypanosoma cruzi.