65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 6. Bioquímica

ENZIMAS HIDROLÍTICAS E INIBIDORES DE PROTEASES EM SEMENTES DE Ormosia arborea (Vell.) Harms

Larissa Juliana da Costa Silva - Aluna de graduação em Biologia-Bacharelado (UVA) Lucilene Silva Pereira Soares - Prof. Dra. Curso de Ciências Biológicas/Universidade Estadual Vale do Acaraú-UVA Marlene Feliciano Figueiredo - Prof. Dra. Curso de Ciências Biológicas/Universidade Estadual Vale do Acaraú-UVA Lúcia Betânia da Silva Andrade - Profa. Dra./Orientadora- Curso de C. Biológicas (UVA)

INTRODUÇÃO:

Proteínas são amplamente encontradas em sementes de leguminosas e seu teor pode variar entre 10% e 40%. A diversidade funcional e estrutural destas moléculas é extensa podendo atuar como proteínas de reserva, fonte importante de aminoácidos para o crescimento e desenvolvimento da planta, enzimas para mobilização das reservas, como proteases e amilases, ou ainda como proteínas de defesa incluindo lectinas, inibidores de proteases e proteínas antimicrobianas (CÂNDIDO et al., 2011;WILSON, 2012). Ormosia arborea (Vell.) Harms, conhecida como olho-de-cabra, é uma árvore nativa do Brasil ocorrendo nos Estados da Bahia, Minas Gerais, Mato Grosso do Sul e Santa Catarina, principalmente na floresta pluvial atlântica e latifoliada semidecídua (LORENZI, 2002). Suas sementes coloridas são muito utilizadas na produção de peças artesanais por comunidades locais e apesar da árvore produzir anualmente uma grande quantidade de sementes viáveis, geralmente apresenta baixa frequência, podendo ser considerada uma espécie rara (PICOLO et al., 2012), sendo escassas informações acerca dos constituintes químicos de suas sementes.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Identificar enzimas hidrolíticas (amilases, celulases e proteases) e inibidores de proteases em sementes de O. arborea e caracterizar o perfil de proteínas por eletroforese.

MÉTODOS:

Sementes de O. arborea foram coletadas no Município de Graça-Ce. As sementes foram descascadas e trituradas até a obtenção de uma fina farinha. Para estabelecer as melhores condições de extração das proteínas investigadas, proteínas solúveis foram extraídas da farinha com 5 diferentes soluções: água destilada, NaCl 0,2 M, acetato de sódio 50 mM pH 5.5, tris/HCl 50 mM pH 7.5, fosfato de sódio 0,1 M pH 6,7. A extração foi realizada sob agitação, por 1 hora, na proporção de 1:10 (m/v), centrifugadas por 30 minutos a 10.000xg. Os sobrenadantes (EB) foram usados para as análises bioquímicas. Proteínas totais foram quantificadas pelo método de Bradford (1976). A análise qualitativa de proteases, amilases e celulases foi feita pelo método de difusão em ágar usando como substrato leite desnatado, amido e carboximetilcelulose, respectivamente. O perfil de proteínas das sementes foi visualizado por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e o perfil enzimático por zimograma. A presença de Inibidor de papaína foi avaliada pelo método de Abe et al., (1987) e de inibidor de tripsina pela metodologia de Kakade, et al., (1974).

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Um maior rendimento na extração de proteínas solúveis foi obtido com o tampão fosfato (6,43 mg/mL) seguido pelo tampão Tris/HCl (5,73 mg/mL). As demais soluções apresentaram teor de proteínas de 3,01 mg/mL (NaCl 0,2 M), 2,61 mg/mL (tampão acetato) e 1,99 mg/mL (água destilada). Na avaliação para a atividade de amilases, celulases e proteases, a atividade enzimática foi qualitativamente maior nos extratos obtidos com tampão fosfato, isto pode ser explicado pelo fato de que foi esta a solução que extraiu uma maior quantidade de proteínas. O perfil eletroforético de proteínas revelou a maior presença de bandas entre 12 kDa e 60 kDa, sendo que em todos os extratos houve a predominância de uma banda de aproximadamente 45 kDa. O zimograma para amilase mostrou o aparecimento de uma banda em torno de 60 kDa com atividade amilolítica. Não foi detectada atividade para proteases ou celulases por zimograma e isto pode ser devido a não renaturação das proteases e celulases após a corrida eletroforética. O EB extraído com água apresentou maior potencial inibitório para papaína (87,53%) enquanto o máximo de atividade inibitória para tripsina foi alcançado pelo EB obtido com o tampão Tris/HCl (39,5%).

CONCLUSÕES:

O extrato de sementes de O. arborea apresentou atividade amilásica, celulásica e proteásica sendo o tampão fosfato de sódio 0,1 M pH 6,7 a melhor solução para extração destas enzimas, nas condições testadas. Os extratos também apresentaram atividade de inibição da papaína e tripsina, sendo que para esta última a atividade de inibição foi menor. Estes resultados indicam que sementes desta espécie possuem potencial fonte de proteínas bioativas e apresentam informações sobre o perfil bioquímico das sementes desta espécie visando, assim, acrescentar dados na literatura que possam contribuir para o conhecimento de plantas nativas de nossa flora.

Palavras-chave: Amilases, Celulases, Proteínas Bioativas.