65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 7. Fisiologia - 3. Fisiologia de Orgãos e Sistemas

Estudo in vitro da atividade placentária de ratas Wistar tratadas com ciclofosfamida.

Marina Pinheiro Guerreiro - Depto. de Ciências Fisiológicas. FCMS/ PUC-SP. Ellen Jacqueline Souza Dias - Depto. de Ciências Fisiológicas. FCMS/ PUC-SP. Mércia Tancredo Toledo - Profª. Drª./Orientadora - Depto. de Ciências Fisiológicas. FCMS/ PUC-SP.

INTRODUÇÃO:

A placenta é um órgão onde ocorrem todas as trocas sanguíneas entre a mãe e o feto, apresentando funções alimentares, endócrinas, hepáticas, entre outras. Alguns fatores podem interferir negativamente na gestação, como o uso de substâncias inadequadas,e podem alterar o desenvolvimento e a função placentária. A ciclofosfamida é uma droga antineoplásica, utilizada no tratamento quimioterápico e de doenças autoimunes e é inativa até ser metabolizada no fígado. A ciclofosfamida pode ser teratogênica ou causar reabsorção fetal, quando usada durante a gestação. O termo citotoxicidade significa causa de efeitos tóxicos (morte, alterações na permeabilidade da membrana celular, inibição enzimática) a nível celular. O teste de MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5- difeniltetrazólio )é um método desenvolvido para avaliar a viabilidade celular verificando a atividade de uma enzima mitocondrial. A redução do MTT, ocorre apenas em células viáveis, sendo sua densidade diretamente proporcional ao número de células presentes. Os métodos in vitro apresentam vantagens em relação aos in vivo tais como poder limitar o número de variáveis experimentais, obter dados significativos mais facilmente. Com o controle cada vez mais rigoroso em relação ao uso de animais de laboratório, há a necessidade de desenvolver e padronizar novos testes in vitro.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Este trabalho teve por objetivo, avaliar a viabilidade celular placentária através do cultivo de células placentárias de ratas Wistar sacrificadas ao 20º dia, e submetidas ao tratamento com concentrações de clofosfamida (50 mg/mL, 25 mg/mL e 12,5mg/mL).

MÉTODOS:

Foram utilizadas 08 fêmeas Wistar adultas prenhas. As placentas foram removidas e separadas para o cultivo celular, o tecido placentário foi macerado, picotado e submersos a uma solução de PBS contendo 1% de penicilina, estreptomicina e 10% fungicida, e divididas em garrafas de cultivo estéreis com meio de cultura DMEM 12%, que foram armazenadas em estufas à 37C com 5% de CO2. O teste de viabilidade celular foi desenvolvido com a ciclofosfamida, em ensaios com a dose 50mg, 25mg e 12,5 mg. O fármaco só é ativo pelo fígado. Para ativação in vitro, 30 microlitros de fração S9 do fígado foi adicionado ao meio. Foi utilizada S9 de fígado de rato, obtida comercialmente. Para a análise da citotoxicidade 5x105 cel/mL, foram incubadas durante dois tempos de 24 e 72 horas. Após, as células foram lavadas com PBS adicionando meio DMEM contendo MTT (5mg/mL) por um período de 4 horas a 37C no escuro. Após esse tempo MTT foi substituído por dimetil sulfóxido (DMSO) e tampão Glicina/Sorensen. Em seguida, o MTT foi lido em leitor de microplacas Elx-800-UV (Bio-Tek Instruments, EUA) 570 nm. O crescimento celular foi registrado pelo software NIS-Elements Advanced Research (ver. 3.00). A análise estatística foi feita pelo programa GraphPad instat por Anova, teste de Kruskall-Wallis, e pelo teste de Dunn’s.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

As células placentárias apresentam um crescimento lento, quando não diferenciadas. Elas permaneceram suspensas no meio de cultura até 72 horas. A aderência celular apresentou uma expansão celular e atingiu sua máxima confluência ao 15º dia. As células placentárias formam bicamadas ao 21º dia, porém, após este período entram em apoptose. O teste de citotoxicidade tem contato direto com culturas celulares. Valores de absorbância mais baixa do que o controle indica a redução da taxa de proliferação celular. Os valores obtidos para as concentrações de 12,5 mg/mL, 25 mg/mL e 50 mg/mL, indicam o aumento gradual da absorbância na leitura de 72 horas quando comparada a leitura de 24 horas. Notou uma propriedade tóxica para a concentração de 12,5 mg/mL após 72h (p>0,05). Para as demais concentrações não foi significativo, suspeita-se da não ativação da ciclofosfamida pela fração S9. Os resultados demonstraram que a ciclofosfamida quando utilizada nessas concentrações não atingem a potencialidade de um valor de concentração inibitória de 50% (CI50). Os resultados obtidos Messias (2009) através do MTT mostram que o arcabouço polimérico não foi tóxico às células e o fenol1% sim. Essa afirmação condiz com nossos resultados, onde o potencial citotóxico da ciclofosfamida foi significativo na concentração de 12,5 mg/mL para controle positivo. A ciclofosfamida pode ser teratogênica, quando usada durante a gestação, porém no nosso trabalho ela não desenvolveu mecanismo de toxicidade celular.

CONCLUSÕES:

Os resultados estatísticos entre os grupos controle e experimental nas diversas concentrações notou-se que a ciclofosfamida foi ativada pela fração microssomal S-9 e convertida à sua forma ativa apenas na concentração de 12,5 mg/mL. Não se pode afirmar com certeza que nas demais concentrações 25 e 50 mg/mL a ciclofosfamida não foi ativada, mas devido ao grau de absorbância existem fortes indícios da não ativação pela fração microssomal S-9, uma vez que, nessas concentrações os graus de absorbância foram parecidos com o do grupo não tratado (controle negativo), suspeita-se que a quantidade utilizada da enzima foi insuficiente, necessitando de mais estudos com outras quantidades desta fração microssomal S-9. A atividade celular placentária foi significativamente interferida pela ação da ciclofosfamida na concentração utilizada de 12,5 mg/mL após 72 horas de tratamento em relação ao controle negativo, esse foi o único resultado que obteve grau de significância. Nos grupos experimentais tratados com 25 e 50 mg/mL o grau de absorbância foi semelhante ao grupo controle negativo nas 24 e 72 horas. Portanto, mais estudos são necessários para afirmar a ação e a toxicidade da ciclofosfamida com células placentárias de ratas Wistar.

Palavras-chave: Viabilidade Celular, Placenta, Ciclofosfamida.