65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 4. Genética Molecular

SELEÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES (RAPD E ISSR) E COMPARAÇÃO DE COEFICIENTES VISANDO ESTIMATIVAS DE DIVERSIDADE GENÉTICA PARA Croton heliotrophifolius

João Guilherme Portugal Vieira - Depto. de Estudos Básicos e Instrumentais - UESB Zanon Santana Gonçalves - Depto. de Estudos Básicos e Instrumentais - UESB Murilo Marques Scaldaferri - Depto. de Estudos Básicos e Instrumentais - UESB Janaína Silva Freitas - Depto. de Estudos Básicos e Instrumentais - UESB Elisa Susilene Lisboa dos Santos - Depto. de Estudos Básicos e Instrumentais - UESB Carlos Bernard Moreno Cerqueira Silva - Depto. de Estudos Básicos e Instrumentais - UESB

INTRODUÇÃO:

A Caatinga é um bioma de características únicas, rico em biodiversidade, endemismo, heterogêneo e por diferentes fatores considerado frágil. Em linhas gerais este bioma apresenta uma vegetação característica do sertão nordestino, sendo em sua maioria coposta por plantas adaptadas a baixa disponibilidade de água ao longo do ano. Dentre as espécies da caatinga, aproximadamente 70 pertencem ao gênero Croton. Este gênero é o segundo mais rico e diverso da família Euphorbiaceae, tendo-se como exemplo do gênero o Croton heliotrophifolius, popularmente conhecido como ‘trequeté’, ‘cassutinga’ e ‘velame’, que apresenta potencial fitoterápico e bioinseticida. Tendo em vista esse biopotencial, o C. heliotrophifolius, bem como a sua ocorrência em regiões degradadas, mostra-se natural a necessidade de ações que visem à prospecção sustentável e a caracterização de sua variabilidade genética. Marcadores moleculares são importantes ferramentas no desenvolvimento de estudos de diversidade e melhoramento genético. Entre os marcadores, podemos destacar os RAPD e ISSR, que são multilocos, altamente polimórficos e requerem pouco investimento. Todavia, não há relatos de estudos envolvendo marcadores moleculares do tipo RAPD e ISSR para C. heliotrophifolius.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Identificar marcadores moleculares (RAPD e ISSR) polimórficos e coeficientes de agrupamento que permitam estimar com segurança e qualidade a diversidade genética de populações selvagens de Croton heliotrophifolius.

MÉTODOS:

Foram amostrados 42 genótipos de C. heliotrophifolius, oriundos de áreas nativas circunvizinhas ao município de Itapetinga-BA, cujo DNA encontra-se armazenado no Laboratório de Genética Molecular Aplicada da UESB (Itapetinga, BA). A seleção dos primers foi realizada com base em testes de amplificação de 23 primers ISSR e 20 primers RAPD. O programa de amplificação adotado para as reações de RAPD segui rotinas de amplificação amplamente discutidas na literatura, tendo como condições de pareamento a permanência a 34º por 50 seg. Para as reações de ISSR seguiu o programa proposto por Santos (2011) com algumas modificações. Os produtos da amplificação foram resolvidos por eletroforese em gel de agarose 2% (m/v) imerso em tampão TBE 1X, com voltagem constante de 120 V por duas horas e, visualizadas em sistema de fotodocumentação com incidência de luz UV. A transformação das imagens em matriz de dados binários foi realizada por dois pesquisadores. Foram avaliadas a Distância Binária de Sokal (DB), Coincidência Simples (CS), Rogers e Tanimoto (RT), Sokal e Sneath (SS), Russel e Rao (RR), Jacard (J), Dice (D), Ochiai (O), Baroni; Urbani e Buser (BUB) e Índice II (I - II). Também foi considerada a eficiência de oito diferentes métodos de agrupamento, tendo como parâmetros os valores de correlação cofenética, distorção e estresse. As análises estatísticas foram realizadas com os programas GENES e Bioestat 5.0.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Foram identificados 12 primers polimórficos para RAPD e 15 para ISSR, apresentando uma média de 3,5 e 4,26 bandas por loco amplificado, respectivamente. A matriz de correlação gerada a partir do uso dos coeficientes apresentou correlação de 100% (r=1) entre alguns dos índices testados, a exemplo da correlação entre os índices CS, RT e DB. Contrastando com esses resultados podemos citar uma baixa correlação (r < 0,85) entre os índices RR, DB e CS. Variações nos resultados de estimativas de diversidade, em decorrência do uso de diferentes coeficientes de distancias estão disponíveis na literatura para outras espécies, a exemplo de Passiflora spp. As diferentes combinações entre coeficientes de distância e métodos de agrupamento apresentaram resultados distintos em relação à eficácia da matriz de agrupamento. Os métodos WPGMA (0,52 < CCC <0,79; -3,68 < D < -14,83; 5,67 < S < 13,24) e UPGMA (0,56 < CCC < 0,80; 0,24 < D <1,26; 4,87 < S < 10,99) foram os métodos que apresentaram resultado mais próximo do desejável em C. heliotrophifolius, estando estes valores de acordo com resultados disponíveis na literatura para outras espécies silvestres e comerciais.

CONCLUSÕES:

Os marcadores ISSR e RAPD mostram-se adequados para estudos genéticos em C. heliotrophifolius, sendo possível a indicação de ao menos 15 primers ISSR e 12 primers RAPD para estudos desta espécie. A escolha dos coeficientes a serem utilizados para estimar a diversidade genética de C. heliotrophifolius mostra-se uma etapa importante, visto que diferentes coeficientes podem gerar resultados distintos, sendo portanto indicado a padronização da metodologia a ser empregada. Deste modo não apenas se garante a qualidade do estudo, como facilita-se posteriores comparações entre diferentes estimativas de diversidade. Com relação aos métodos de agrupamento, ficou evidente a eficiencia diferenciada entre os oito métodos testados, destacando-se o método da média aritmética não ponderada, o UPGMA, como sendo o mais indicado.

Palavras-chave: Croton, Marcadores Genéticos, Variabilidade Genética.