65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 6. Bioquímica

DESENHO RACIONAL, SÍNTESE E PURIFICAÇÃO DE A2, UM ANÁLOGO DO PEPTÍDEO PENTADACTILINA

Bárbara Nayara Dantas Oliveira - Curso de Farmácia - Universidade de Brasília (UNB) Aline Barbosa Guimarães - Depto. de Biologia Celular - UNB Mariana de Souza Castro - Orientadora - Depto. de Biologia Celular e Depto. de Ciências Fisiológicas - UNB

INTRODUÇÃO:

As secreções cutâneas dos anuros são complexas misturas que atuam na defesa contra predadores e microorganismos. Entre seus componentes, os peptídeos antimicrobianos (PAM) apresentam grande destaque, principalmente por serem potenciais alternativas aos antibióticos existentes, tendo em vista a crescente resistência observada. A pentadactilina, um PAM catiônico composto por 25 resíduos de aminoácidos, isolado da secreção de Leptodactylus pentadactylus e Leptodactylus labyrinthicus, apresenta suas atividades biológicas descritas na literatura (atividades antimicrobianas e hemolíticas relativamente baixas). Estes dados motivaram o presente trabalho, que visou otimizar os efeitos do peptídeo selvagem, por meio de modificações em sua estrutura primária e obtenção de um análogo do PAM pentadactilina por meio de síntese química para testá-lo contra bactérias patogênicas, com vistas à produção de produtos biotecnológicos de interesse médico.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Otimizar a atividade do peptídeo selvagem, pentadactilina, por meio de modificações em sua estrutura primária e obtenção de um análogo, a fim de aumentar sua ação antimicrobiana e diminuir sua citotoxicidade.

MÉTODOS:

Após o planejamento racional, o peptídeo A2, com 14 aminoácidos, foi sintetizado de forma automatizada (Sintetizador de Peptídeos PSSM-8, Shimadzu), de acordo com a metodologia padrão de síntese de peptídeo em fase sólida, conforme estratégia Fmoc. A resina Rink-Amide foi empregada como suporte sólido para a obtenção de peptídeo amidado como produto final. Os derivados de aminoácidos utilizados foram: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(t-Bu)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH e Fmoc-Val-OH, ativados com TBTU e extraídos da resina com um coquetel de extração contendo anisol, TFA e etanoditiol. Para a purificação dos peptídeos, foi realizada cromatografia líquida de alta eficiência com coluna de fase reversa e gradientes de dois eluentes: 0,1% TFA (fase A) e ACN/0,1% TFA (fase B). Para a detecção empregou-se detector de ultravioleta (&lambda máx =216 nm). As frações obtidas da purificação de cada peptídeo foram coletadas e liofilizadas para posterior utilização. Através da análise das frações em um espectrômetro de massa Autoflex II TOF/TOF (Bruker Daltonics, Alemanha), avaliou-se a pureza do análogo sintetizado, assim como foi possível identificar o conteúdo de cada fração coletada.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

O desenho racional de análogo peptídico da pentadactilina resultou na síntese de um novo composto, denominado A2, cuja massa molecular é 1369,483 Da. No cromatograma de purificação do análogo A2, o peptídeo obtido corresponde ao pico cromatográfico com tempo de retenção (tR) de 31,230 min. A análise dos picos cromatográficos mostrou a presença de diversos componentes obtidos pós-síntese de A2, alguns com menor massa, correspondendo ao caso de síntese incompleta ou perda de um ou dois resíduos na porção C-terminal, outros com massa superior à esperada, sugerindo que a etapa de clivagem do peptídeo tenha sido incompleta. A análise da fração mais intensa para este caso (tR 19,324 min) não apontou a presença de componentes na fração, o que sugere que este pico corresponde a componentes de baixa massa, como os grupos de proteção utilizados para os aminoácidos, uma vez que a sequência primária do análogo A2 não apresenta resíduos com cadeias laterais aromáticas, o que caracterizaria uma absorção neste comprimento de onda. No espectro de massas para o análogo A2, após a etapa de purificação, o pico experimental observado foi de 1369,483 Da (valor teórico 1369,70), sendo que os valores de massas subsequentes se tratam dos adutos de sódio e potássio.

CONCLUSÕES:

A estrutura primária da pentadactilina foi analisada com vistas a se produzir mutações nas faces polares e apolares da molécula, visando à obtenção de análogos cuja atividade microbicida seja mantida e/ou aumentada. As frações purificadas serão submetidas a ensaio in vitro para avaliação da atividade microbicida (contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas) e hemolítica (contra eritrócitos humanos). Com isso, é esperado que os efeitos da potencialização da atividade citotóxica não resultem em efeitos tóxicos sobre o organismo hospedeiro.

Palavras-chave: Atividade antibacteriana, Síntese em fase sólida, Espectrometria de massa.