65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 10. Microbiologia - 3. Microbiologia

Epidemiologia Molecular do vírus Influenza A (H1N1) pandêmico: investigação de determinantes de patogenicidade nos genes codificadores da hemaglutinina e PB2.

Deimy Lima Ferreira - Laboratório de Vírus Respiratórios / Instituto Evandro Chagas Jessylene de Almeida Ferreira - Msc. / Laboratório de Vírus Respiratórios / Instituto Evandro Chagas Mirleide Cordeiro dos Santos - Msc. / Orientadora / Pesquisadora Adjunto Instituto Evandro Chagas Luana Soares Barbagelata - Msc. / Laboratório de Vírus Respiratórios / Instituto Evandro Chagas Rita Catarina Medeiros Souza - Profª. Dra. do departamento de infectologia da UFPA Wyller Alencar de Mello - Dr. Chefe do laboratório de Vírus Respiratórios

INTRODUÇÃO:

A gripe é uma infecção respiratória aguda de origem viral, altamente contagiosa, considerada como o paradigma das doenças virais, devido sua evolução genética contínua, causando epidemias anuais e ocasionalmente pandemias, no homem e em animais, sendo uma importante causa de morbidade e mortalidade. Os agentes responsáveis pela gripe são os vírus Influenza de tipo A, B e C, pertencentes à família Orthomyxoviridae. Os vírus de tipo A são mais severas no homem que os vírus de tipo B e C, por apresentar maior variabilidade, o que o torna mais instável, resultando em maior frequência de mutações. A recente pandemia de gripe de 2009/2010 causada pelo vírus A (H1N1) pandêmico mostrou um perfil de gravidade diferente da gripe sazonal, pois um percentual considerável de casos graves e fatais ocorreu em indivíduos adultos jovens, sem comorbidade. A virulência dos vírus Influenza A (H1N1) pandêmico resulta de interações protéicas complexas e depende essencialmente de alguns genes virais. Os temores atuais são de que mutações no genoma do vírus possam elevar seu potencial de patogenicidade. Nesse sentido, estudos estão sendo desenvolvidos em todo o mundo, com intuito de demonstrar os principais fatores virais que possam estar associados à maior virulência e patogenicidade.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Descrever os possíveis determinantes de moleculares de virulência do vírus Influenza A H1N1 pandêmico, nos genes codificadores da Hemaglutinina (HA) e Polimerase Básica 2 (PB2) mediante a analise de cepas provenientes de pacientes com gripe procedente da mesorregião metropolitana de Belém-PA.

MÉTODOS:

A população investigada foi constituída de 87 amostras aleatórias de ambos os sexos de 0 a 96 anos, com síndrome respiratória aguda grave (SRAG) sem comorbidade relatada, entre maio de 2009 a agosto de 2010. As amostras foram isoladas em cultura de célula Madin Darbin Canine Kidney Cell (MDCK) e analisadas por técnicas de biologia molecular sendo: a) extração do RNA viral (RNAv) a partir do sobrenadante celular com kit comercial QIAamp® Viral RNA Mini Kit (Qiagen), seguindo as orientações do fabricante; b) amplificação do RNAv pela técnica de Reação em Cadeia mediada pela Polimerase precedida de Transcrição Reversa (RT-PCR) kit comercial SuperScript III TM One-step qRT-PCR with Platinum Taq- (Invitrogen Life Technologies) c) sequenciamento completo dos genes codificadores da HA e PB2 em sequenciador automático ABIPrism 3130xl (Applied Biosystem) (Max 1300 caracteres).

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Foram isolados em cultura de células MDCK 87 cepas do vírus Influenza A (H1N1) pdm. Destas, foi realizado o sequenciamento completo de 81 amostras para os genes da HA (1778 nucleotídeos) e 82 amostras para PB2 (2341 nucleotídeos). A análise comparativa das sequências obtidas com a sequência da cepa vacinal (A/California/07/2009(H1N1)) revelou substituições aminoacídicas na HA (P83S; D97N; S203T; D222G; Q293H e I321V) e na PB2 (K340N; K526R e M631L). Ao nível de substituição na HA, a D97N isolada ou associada com a S203T, foi detectada com mais frequência na primeira onda ano de 2009. Já ao nível da PB2 a substituição K526R foi mais encontrada em cepas que circularam na primeira onda, enquanto que, a M631L foi mais evidenciada na segunda onda da pandemia ano de 2010. A substituição D222G na HA só foi encontrada em casos de óbitos, observou-se uma tendência de alterações nos sítios antigênicos da HA. Logo, a contínua vigilância genética e antigênica do vírus da gripe em circulação bem como o compartilhamento rápido de informações é de extrema importância para a melhor recomendação possível para os vírus que entram na composição vacinal, evitando assim maior risco de epidemias severas futuras.

CONCLUSÕES:

A caracterização genética das proteínas HA e PB2 revelou alto grau de conservação e similaridade com a sequência da cepa vacinal. O presente estudo demonstrou que o vírus Influenza A (H1N1) pdm 2009/2010 apresentou variadas alterações aminoacidicas nos genes da HA e PB2, em casos de óbitos e de SRAG sem comorbidade. Tais substituições resultaram na mudança conformacional da proteína. Foi possível relatar à ocorrência de importantes substituições aminoacídicas em ambas as proteínas das cepas analisadas. As substituições encontradas, D222G na HA e K340N na PB2, estiveram associadas à ocorrência de casos fatais de infecção pelo vírus Influenza A H1N1 pdm.

Palavras-chave: Influenza A pandêmico, Hemaglutinina, Polimerase Básica.