65ª Reunião Anual da SBPC

E. Ciências Agrárias - 5. Medicina Veterinária - 3. Medicina Veterinária Preventiva

GENOTIPIFICAÇÃO DE Actinobacillus pleuropneumoniae ATRAVÉS DE ERIC-PCR

Cintia Simoni - Laboratório de Biologia Molecular Aplicada – UFRGS Sérgio Ceroni da Silva - Prof. Dr./Orientador - Laboratório de Biologia Molecular Aplicada – UFRGS Luiza Amaral de Castro - Dra./Coorientadora - Laboratório de Biologia Molecular Aplicada – UFRGS

INTRODUÇÃO:

O Actinobacillus pleuropneumoniae é o agente da pleuropneumonia suína, doença infecto-contagiosa amplamente distribuída no rebanho suíno mundial e de importância econômica significativa, podendo afetar suínos susceptíveis de várias idades. O agente possui 15 sorotipos conhecidos, os quais podem apresentar reações cruzadas em testes diagnósticos, dificultando a sorotipificação. A determinação do sorotipo de ocorrência em um dado surto e/ou região é importante na promoção da profilaxia, mas não é a única exigência para um efetivo controle. Em razão da diversidade genética e das diferenças na virulência entre as amostras, mesmo em amostras de um mesmo sorotipo, é necessário o desenvolvimento de métodos que possam diferenciar as amostras isoladas a campo em diferentes surtos da doença. A genotipificação dos isolados de campo, juntamente com análises filogenéticas, será capaz de aprimorar o estudo epidemiológico do agente no nosso meio e superar as dificuldades hoje encontradas pela sorotipificação.

OBJETIVO DO TRABALHO:

O objetivo deste trabalho é o de desenvolver e padronizar técnicas de biologia molecular, visando a genotipificação de isolados de A. pleuropneumoniae. Dentre as técnicas disponíveis, o ERIC-PCR é uma das mais promissoras. O padrão de amplicons gerado pela técnica também deverá permitir minuciosa análise filogenética das amostras isoladas de campo.

MÉTODOS:

O DNA genômico das amostras de campo utilizadas foi extraído utilizando o Kit QIAmp DNA Mini (Qiagen) e quantificado através do Kit Quant-iT dsDNA HS Assay (Invitrogen), conforme instruções dos fabricantes. A quantidade de DNA utilizada em cada reação foi de 500 pg/μL. Cada reação de PCR, em um volume final de 25 μL, continha 2,5 μL de tampão de PCR 10x, 3 mM de MgCl2, 2,5 Unidades de Taq DNA polimerase, 0,2 mM de dNTPs e 20 pmol de cada um dos primers. Os ciclos de amplificação consistiam de 95ºC por 2 minutos, seguido de 35 ciclos a 94ºC por 30 segundos, 50ºC por 1 minuto e 72ºC por 2,5 minutos, com extensão final de 72ºC por 20 minutos. Os amplicons foram separados por eletroforese em gel de agarose UltraPure 1,5%, a 85 V (8,5 V/cm) em tampão TBE 1x por 3 horas, e fotografados. Os amplicons foram analisados pelos softwares Gel-Pro Analyser e RAPDistance. A partir da matriz binária gerada pelos fragmentos obtidos pela técnica de ERIC-PCR, foram calculadas as distâncias filogenéticas das amostras, através do coeficiente de Nei & Li.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Em experimentos iniciais, foi utilizado DNA obtido dos sorotipos de referência de A. pleuropneumoniae (sorotipos 1 a 14) para estabelecer as concentrações ótimas dos reagentes. Com estas amostras de referência, foi possível obter um padrão de amplificação inequívoco para o DNA de cada um dos sorotipos analisados. Os experimentos iniciais indicaram que, nas condições padronizadas, a técnica apresentou reprodutibilidade quando aplicada em amostras em duplicata. Após esta etapa inicial de padronização, a técnica foi aplicada em 29 amostras de campo obtidas de casos clínicos e isoladas no Centro Nacional de Pesquisa de Suínos e Aves (CNPSA/EMBRAPA). Todas as amostras geraram padrões de amplificação diferenciados, inclusive em amostras de mesmo sorotipo, permitindo a distinção efetiva das diferentes amostras de campo. O padrão de amplicons gerado pelo ERIC-PCR permite a construção de uma matriz binária passível de uma detalhada análise filogenética, impossível de ser feita pela simples inspeção visual do resultado da eletroforese em gel de agarose. Através da análise filogenética realizada, todas as amostras puderam ser identificadas e caracterizadas individualmente, podendo ser agrupadas em sub-populações filogeneticamente relacionadas.

CONCLUSÕES:

Através dos experimentos realizados, conclui-se que a técnica ERIC-PCR permite a diferenciação efetiva de amostras isoladas de campo de A. pleuropneumoniae. A partir dos resultados obtidos, é possível a realização de estudos epidemiológicos mais detalhados do agente no nosso meio. As informações extraídas serão relevantes para o entendimento da doença, com reflexos práticos nas medidas de controle e prevenção. Outro ponto chave no controle do agente através do ERIC-PCR é a possibilidade de rastrear as cepas isoladas em cada surto, principalmente em granjas de controle por vacinação e granjas que alcancem, ou busquem alcançar, a erradicação da doença. A pesquisa alcançou seus objetivos na diferenciação dos isolados, porém, outros métodos devem ser pesquisados e padronizados para auxiliar a sorotipificação e a genotipificação do agente. Entre eles podemos citar a identificação dos genes que codificam para as toxinas Apx (Actinobacillus pleuropneumoniae RTX toxins) e a técnica RFLP ( restriction fragment length polymorphism), que podem agregar informações importantes na rastreabilidade e genotipificação do agente.

Palavras-chave: Pleuropneumonia suína, ERIC-PCR, Genotipificação.