65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 3. Enzimologia

CARACTERIZAÇÃO DE PROTEASES EM FRUTOS VERDES DE ACHACHAIRU (Garcínia humlis Vahl.)

Gilvany Rodrigues de Andrade - Doutoranda em Biotecnologia - Rede Nordeste de Biotecnologia - RENORBIO Gileno Vitor Mota Lima - Doutorando em Botânica - Depto. de Biologia - UFRPE Maria Taciana Cavalcanti Soares - Profa. Dra. - Depto. de Morfologia e Fisiologia Animal - UFRPE Ana Lúcia Figueiredo Porto - Profa. Dra./ Orientadora - Depto. de Morfologia e Fisiologia Animal - UFRPE

INTRODUÇÃO:

O achachairu ((Garcínia humlis Vahl.) é uma planta oriunda da Bolívia e bem adaptada em nossa região. No Brasil, é pouco conhecida e confundida pelo público leigo como frutas de outras espécies. Dentre os compostos biologicamente ativos, as proteases são enzimas fisiologicamente essenciais à sobrevivência de todos os seres vivos podendo ser obtidas de diferentes fontes como animais, microorganismos e plantas. Nos últimos anos, as proteases são utilizadas com diversas finalidades, no processso industrial da fabricação de detergentes, alimentos, na recuperação e reaproveitamento de resíduos e subprodutos. As proteases vegetais receberam uma atenção na indústria e na biotecnologia farmacêutica devido à propriedade de ser ativa em larga escala quando em alta temperatura e pH. Elas possuem uma importante aplicação comercial, estando entre os três maiores grupos de enzimas industriais, sendo responsáveis por 60% da venda internacional. O pH influencia a ionização dos aminoácidos constituintes de enzimas, alterando sua conformação e atividade. Valores de pH altos levam a desnaturação. A temperatura influencia de forma positiva a atividade enzimática, o aumento da temperatura acelera a velocidade das reações, mas este efeito é contrariado pela desnaturação das moléculas da enzima.

OBJETIVO DO TRABALHO:

O presente trabalho visou caracterizar as enzimas no extrato de casca de frutos verdes de achachairu quanto às seguintes variáveis: pH e temperatura ótima, estabilidade ao pH e a temperatura.

MÉTODOS:

O efeito do pH na atividade proteásica foi avaliado pela mistura do extrato vegetal com o substrato azocaseína 1% (p/v), preparado em tampões 0,05 M com diferentes valores de pH: citrato de sódio (pH 4,0 e 5,0); fosfato de sódio (pH 6,0 e 7,0); Tris-HCl (pH 7,0 e 8,0) e Carbonato-bicarbonato (pH 9,0 e 10,0), logo após realizou-se as determinações da atividade. Para a determinação da estabilidade da enzima ao pH, o extrato foi incubado com cada um dos tampões citados à temperatura ambiente. Para a determinação da estabilidade da enzima ao pH retirou-se amostras a cada 30 minutos durante 90 minutos, para a determinação da atividade proteásica. O efeito da temperatura na atividade proteásica foi avaliado utilizando-se uma mistura de reação contendo, azocaseína 1% (p/v), e o extrato vegetal, incubados nas temperaturas de 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C 60°C, 65°C, 70°C ,75°C, 80°C, 85°C e 90°C por 1 hora, para posterior determinação da atividade. Para a determinação da estabilidade térmica, o extrato foi pré-incubado em temperaturas de 30°C à 90°C. O tempo de incubação total foi de 90 minutos, retirando-se amostras a cada 30 minutos, para a realização da atividade proteásica. Os dados foram submetidos a analise estatísticas utilizando o teste de Tukey a nível de 5%.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

O extrato enzimático apresentou atividade em ampla faixa de pH (4 e 10) com maiores atividades em pHs 4 e 8 sendo estatisticamente significativa. A estabilidade ao pH mostrou resultados superiores em pHs 8, 9 e 10 no tempo 0 de incubação além dos pHs 4 e 5 nos tempos 90 e 60 minutos respectivamente. De acordo com França-Santos et al.(2009), as proteases diferem na sua ação em diversos substratos, na oxi-redução e no pH que hidrolisam mais rapidamente seus substratos. O pH ótimo é influenciado pela natureza do substrato, pela concentração, tipo de tampão usado e pela presença de agentes redutores. Logo, para determinadas proteases também presentes no extrato vegetal podemos encontrar atividade em determinadas faixas de pH como demonstrado neste estudo. Verificou-se atividade proteásica em uma ampla faixa de temperatura (30°C a 90°C), sugerindo que esta enzima é termoestável, pois mantém sua atividade até 90°C sem desnaturar. A temperatura ótima foi verificada a 40°C e 45°C sendo estatisticamente significativa. A estabilidade da protease frente a diferentes temperaturas e tempo de incubação foi superior à 60°C em tempo 0 (117.17 U/mL). Quanto a temperatura pode ter acontecido variações na atividade proteásica devido a outros complexos enzimáticos encontrados no extrato vegetal.

CONCLUSÕES:

Diante do exposto as enzimas proteolíticas presentes no extrato de casca de frutos verdes de achachairu (Garcínia humlis Vahl.) apresentam atividade em uma ampla faixa de pH (4,0 à 10,0) e ampla faixa de temperatura (30°C à 90°C). A temperatura ótima foi verificada a 40°C e 45°C e quanto ao pH ótimo os resultados foram variados, possivelmente resultantes de outras isoformas de enzimas proteolíticas encontradas no extrato vegetal. O conhecimento dessas características bioquímicas da enzima é muito importante, pois reduz a possibilidade de utilizar condições desnaturantes em processos de extração e purificação.

Palavras-chave: Enzimas proteolíticas, Estabilidade, extrato vegetal.