65ª Reunião Anual da SBPC

B. Engenharias - 1. Engenharia - 12. Engenharia Química

HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE UM MACROPEPTÍDEO: MODELAGEM E SIMULAÇÃO DA CINÉTICA REACIONAL

Marcelo Prata Vidal - Prof. Dr. - Depto. de Agrotecnologia e Ciências Sociais - UFERSA

INTRODUÇÃO:

Os reatores enzimáticos já são estudados a mais de 30 anos com objetivo de aproveitar a seletividade da catalise enzimática em uma escala industrial. Uma inovação deste tipo de reator foi proposta em certas bioconversões, pela introdução de membranas filtrantes permitindo em uma mesma etapa a separação dos produtos da reação, do substrato e das enzimas. Um dos problemas que encontramos para a otimização da concepção e modo de funcionamento de tais reatores está na simulação da cinética destas reações. Particularmente, a utilização do modelo cinético comumente utilizado, como por exemplo, o modelo de Michaelis-Menten que mostra seus limites para descrever o comportamento cinético das reações enzimáticas com o funcionamento do reator em modo contínuo. A primeira etapa deste trabalho consiste em estabelecer um mecanismo reacional da hidrolise enzimática (Tripsina) de um Macropeptídeo da caseína (Caseinomacropeptídeo - CMP). Os produtos obtidos desta reação enzimática foram quantificados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) em coluna de fase reversa. A partir destes dados experimentais e de balanços de massa elaboramos um modelo matemático composto por 12 equações diferencias ordinárias não lineares com 13 parâmetros cinéticos. Um programa em linguagem FORTRAN 90 foi construído permitindo a otimização dos parâmetros cinéticos usando um algoritmo de minimização FFSQP (Fortran Feasible Sequential Quadratic Programming).

OBJETIVO DO TRABALHO:

Este trabalho teve os seguintes objetivos principais: - Representação matemática do mecanismo reacional proposto da reação em estudo; - Desenvolvimento de um programa computacional em linguagem Fortran 90, baseado no algoritmo de minimização FFSQP; - Representação gráfica dos perfis e concentração calculado e experimental dos peptídeos produtos da reação em estudos.

MÉTODOS:

A hidrólise do CMP foi realizada em um reator do mistura em regime batelada, com volume de 350 ml, temperatura 40 °C e agitação constante. A concentração da CMP foi de 53,64 µmol.l-1 em um tampão fosfato de sódio 10-3 mol.l-1 a pH 7,5 a concentração da tripsina 0,2 µmol.l-1. As concentrações de quatro peptídeos com atividades antitrombóticas foram determinada por cromatografia (CLAE) em fase reversa, com uma coluna Hypercarb 7 µm (4,6 mm x 100 mm, Life Science, France) em Carbono grafitizado. A fase móvel foi constituída de isopropanol, água MiliQ e Ácido Trifluoracético (TFA). O mecanismo proposto é composto por um conjunto de reações em paralelo e séries. O modelo matemático da cinética é baseado no mecanismo reacional proposto, composto por 12 equações ordinárias não lineares com 13 parâmetros cinéticos e um balanço de massa da concentração de enzima. Um programa em linguagem FORTRAN 90 foi construído baseado no método Runge-Kutta 5ª ordem e no método de otimização, baseado em programação sequencial quadrática (SQP), permitindo a otimização dos 13 parâmetros cinéticos pela minimização de uma função objetivo. A otimização dos parâmetros cinéticos foi obtido por um algoritmo de minimização FFSQP. A função objetivo (fobj) a minimizar é composta pelo somatório da diferença entre o valor das concentrações calculadas e o valor das concentrações experimentais de cada peptídeo, para cada um dos 5 diferentes tempos de reação.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Os resultados da otimização dos 13 constantes cinéticas são: K1(l/µmol.min) =30,9; K2(l/min)= 392,6; K3(l/µmol.min) =8,8; K4(l/.min) =2,9; K5(l/µmol.min) =57,4; K6(l/.min) =156,8; K7(l/µmol.min) =0,209; k8(l/.min) =0,068; ; K9(l/.min) =0,012; ; K10(l/.min) =0,008; K11(l/.min) =0,006; K12(l/.min) =0,09; K13(l/.min) =0,045. A integração das equações diferenciais do modelo proposto permite a visualização dos perfis de concentração dos peptídeos estudados (P1 – Met106 –Lys111, P2 – Met112-Lys116, P3 - Met106-Lys112, P4- Lys113-Lys1160) em função do tempo. Uma primeira simulação foi obtida, considerando a concentração da enzima presente no meio reacional constante, sendo representada pelo balanço de massa. As curvas de concentração calculadas e experimental foram plotadas. A partir destas, concluímos a necessidade de introduzir uma constante cinética referente ao fenômeno de desativação enzimática. A equação proposta, representa uma diminuição exponencial da concentração enzimática em função do tempo, onde Cenz0 é a concentração da enzima (0,2 µmol.l-1) no tempo t = 0 min e kd é a constante de desativação, kd = -1,6x10-3 (min-1).

CONCLUSÕES:

A partir da modelagem do mecanismo da hidrolise do CMP pela tripsina podemos concluir que: A estimação dos parâmetros cinéticos da hidrólise do CMP pela Tripsina é possível a partir da análise experimental das concentrações dos peptídeos formados; A modelagem sugere a importância da etapa de desativação enzimática; Um fenômeno de desativação complexo da enzima com o substrato pode ser o responsável; Este método permite validar quantitativamente o modelo reacional proposto pelo estudo experimental previamente realizado.

Palavras-chave: FFSQP, Cinética Enzimática, Modelagem Matemática.